Nồng độ kháng nguyên HBX được định lượng bằng phương pháp SANDWICH ELISA. Lợi thế của phương pháp này là không cần làm sạch mẫu trước khi đưa vào định lượng, độ nhạy cao hơn 2-5 lần so với phương pháp ELISA trực tiếp và gián tiếp.
Quy trình được thực hiện như sau:
Bước 1: Phủ kháng nguyên
1. Pha loãng kháng nguyên (huyết tương)trong đệm carbonate/bicarbonate buffer (pH7.4) với nồng độ cuối cùng là 20µg/ml. Phủ 100µl huyết thanh bệnh nhân hoặc các mẫu chuẩn lên các giếng. Mỗi mẫu huyết tương hoặc mẫu chuẩn được chạy trên 2 giếng.
2. Đậy nắp giếng bằng tấm plastic và ủ qua đêm ở 4°C.
3. Loại bỏ dung dịch ủ hôm trước và rửa các giếng 3 lần bằng 200 µl PBS.
Bước 2: Cốđịnh mẫu:
4. Phủ các vị trí gắn protein còn lại bằng 200 µl blocking buffer, 5% non fat dry milk/PBS mỗi giếng
5. Đậy nắp các giếng bằng tấm nhựa plastic và ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ
hoặc qua đêm ở nhiệt độ 4°C.
6. Rửa toàn bộ các giếng 2 lần bằng PBS
Bước 3: Ủ với kháng thểđầu tiên ab235 và kháng thể thứ hai ab6728:
7. Thêm 100 µl kháng thể ab235 phát hiện cho mỗi giếng.
8. Đậy các giếng bằng tấm nhựa plastic và ủở nhiệt độ 40C qua đêm 9 Rửa 4 lần bằng 200 µl PBS PBS.
10. Thêm 100 µl kháng thể thứ 2 – ab6728 – đã được pha loãng ở nồng độ tối
ưu trong buffer cốđịnh
11. Đậy các giếng bằng tấm nhựa plastic và ủ 1-2 h ở nhiệt độ phòng. 12. Rửa các giếng 4-5 lần bằng 200 µl PBS.
Các kháng thể , hóa chất đã được pha loãng theo khuyến cáo của abcam (Mỹ).
Bước 4: Phát hiện:
14. Trộn đều 100 µl HRP chromogenes cho các giếng.
15. Dùng cơ chất 100 µl TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidinine ) ủ 15 phút và thêm 100 µl H2SO4 và đọc mật độ quang ở 450nm.
Bước 5: Phân tích kết quả:
Dựa vào các chứng dương với nồng độ kháng nguyên HBx đã biết và các chứng âm. Kết quả thu được so sánh mẫu phân tích (của bệnh nhân) chưa biết so với chứng dương đã biết suy ra nồng độ trong mẫu hoặc kết quả là dương tính hay âm tính. Giá trị của các mẫu được tính bằng số trung bình cộng của 2 giếng.