Trong số tất cả các vùng được mã hóa trên hệ gen HBV, vùng Pre-S
được biết đến như là một vùng có nhiều sự biến đổi về trình tự nhất khi so sánh các kiểu gen HBV với nhau. Thử nghiệm của chúng tôi cho thấy, việc phân nhóm kiểu gen HBV dựa vào trình tự trên vùng Pre-S cho kết quả tương
Hình 2.8: Kết quả phân nhóm 52 trình tự Pre-S của các mẫu đối chứng bằng phương pháp Neibour Joining
Từ nhận định này, chúng tôi đã thiết kế bộ mồi để khuếch đại toàn bộ
vùng Pre-S của HBV (bảng 8). Sản phẩm PCR sử dụng các bộ mồi này sẽ được giải trình tự trực tiếp.
Bảng 2.7: Các bộ mồi khuếch đại vùng Pre-S HBV
Tên Trình tự Kích thước (nt) Tm (0C) HBPre-S outer F 5’- ATACTCTGTGGAAGGCTGGC -3’ 21 53 HBPre-S outer R 5’- TTGAGAGA.AGTCCACCACGAG -3’ 21 50 HBPre-S inner F 5’- TGTGGGTCACCATATTCTTGG -3’ 31 68 HBPre-S inner R 5’- TA.ACACGAGCAGGGGTCCTA-3’ 31 66
Phản ứng PCR của hai bộ mồi HBPre-S inner F/R và HBPre-S outer F/R với các mẫu HBV DNA có kết quảđịnh lượng đạt yêu cầu đều được thực hiện với cùng một chu trình nhiệt: 940C --- 5 phút 940C ---30 giây 550C --- 30 giây 35 chu kỳ 720C --- 30 giây 720C --- 10 phút 40C --- ∞
Bộ mồi HBPre-S inner F/R được dùng làm bộ mồi chính nhân HBV DNA để giải trình tự vùng Pre-S. Đối với các mẫu có nồng độ HBV DNA quá thấp (<104 copies/ml), việc nhân trực tiếp bộ mồi HBPre-S inner F/R thường không phát hiện ra sản phẩm PCR trên bản gel điện di. Do đó cần phải sử
dụng bộ mồi HBPre-S outer F/R để làm giàu thêm khuôn HBV DNA rồi sau
đó thực hiện phản ứng Nested PCR với bộ mồi HBPre-S inner F/R. Các sản phẩm khuếch đại được điện di kiểm tra trên agarose 1%.
Tiến hành giải trình tự (sequencing) vùng Pre-S
Sản phẩm PCR sau khi được nhân thành công bằng cặp mồi HBprS inner F/R sẽđược giải trình tự trực tiếp bằng các bước tiến hành như sau:
• Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít PCR purification của Bioneer (các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất).
• Để kiểm tra độ tinh sạch cũng nhưđịnh lượng một cách tương đối hàm lượng DNA của sản phẩm PCR đã qua tinh sạch, chúng tôi tiến hành điện di lại trên agarose và đo trên máy quang phổở hai bước sóng 260nm và 280nm.
• Sản phẩm PCR sau khi đã qua tinh sạch sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR cho giải trình tự.
¾ Thành phần của phản ứng giải trình tự (sử dụng hóa chất của hãng Beckman Coulter): Bảng 2.8: Thành phần phản ứng giải trình tự Thành phần Thể tích DTCS 5ul Primer 0,5ul H2O 6,5ul
DNA khuôn 3ul
Tổng thể tích phản ứng 15ul
¾ Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 960C ---20 giây
500C --- 20 giây 30 chu kỳ
600C --- 4phút 40C --- ∞
• Sản phẩn PCR cho giải trình tự sẽ được tinh sạch, làm khô bằng Speedvac và hòa lại trong 40µl SLS. Sản phẩn cuối cùng này sẽ được giải trình tự trên hệ thống CEQ8800. (Toàn bộ hóa chất và quy trình được cung cấp bởi nhà sản xuất Beckman Coulter).
Các trình tự sau đó sẽđược xuất ra và phân tích bằng phần mềm BioEdit. Sau khi giải trình tự gene kết quả được so sánh với trình tự chuẩn trên ngân hàng dữ liệu theo địa chỉ trang Web:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGR AMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LI NK_LOC=blasthome.
Sau đó được phân tích trên phần mềm Bioedite 7.05 trên trang Web: http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html.
