Bài 11 : LẬU CẦU
4.2. Nuôi cấy phân lập:
4.2.1. Cách lấy bệnh phẩm:
Chất dịch đường hô hấp: trong những trường hợp viêm phổi, viêm phế quản, viêm
phế quản - phổi.
Đờm: nếu là người lớn, đờm được lấy vào buổi sáng sớm, ho và khạc sâu, đờm
được giữ ở hộp vơ khuẩn rồi chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng vài giờ.
Dịch tỵ hầu: bệnh nhân không khạc được hoặc là trẻ nhỏ dùng tăm bông cán mảnh
mềm lấy chất dịch ở ngã ba mũi - họng theo đường mũi: đưa tăm bông vào sâu bằng một nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra. Chú ý, nếu chưa vào đủ độ sâu đã có vật cản khơng cố lấy, mà phải làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bơng vào khí quản và cán làm bằng kim loại mềm không gỉ, không dễ gẫy khi thực hiện thao tác.
Chất dịch hô hấp lấy bằng máy hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách
ngoáy tỵ hầu. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch.
Ngoáy họng: đè lưỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ẩm bằng nước muối
sinh lý vô khuẩn, chà sát nhẹ 2 hốc A mi đan, thành sau họng. Tránh không được chạm vào lưỡi, răng, mặt trong má và lưỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bơng vào mơi trường vận chuyển.
84
Những trường hợp nghi viêm màng não, dùng kim chọc tủy sống vô khuẩn lấy khoảng 2 - 3ml nước não tủy.
Máu:
Trường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm kim tiêm vơ khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch cho ngay vào bình canh thang não - tim (Brain Heart Infusion: BHI) hay thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử dụng chai cấy máu do các hãng thương mại pha chế sẵn.
Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn
trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình mơi trường qua một ống cao su hay plastic vơ khuẩn. Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn iốt.
Phế cầu khuẩn cũng là một vi khuẩn rất nhạy cảm và dễ chết; vì vậy, tốt nhất các bệnh phẩm nên được chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng 2 giờ hoặc không quá 6 giờ và có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8oC khơng q 24 giờ. Nếu q trình luân chuyển từ 2 - 4 giờ bệnh phẩm có thể được cấy ngay hoặc tăng sinh trước trong canh thang (tryptocasein soya hoặc canh thang não tim) 2 giờ ở 37oC. Nếu thời gian chuyển bệnh phẩm từ 4 - 8 giờ, bệnh phẩm nên được ủ trong canh thang ít nhất là 2 giờ rồi mới cấy ra thạch máu 5%.
Các bệnh phẩm khác: mủ amiđan, mủ tai giữa, dịch chọc phổi 4.2.2 Quy trình phân lập:
Nhuộm soi:
Nhuộm Gram quan sát hình thể và đánh giá số lượng các tế bào viêm (bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào) và vi khuẩn ở trong, ngồi tế bào theo +, ++, +++.
Đếm tế bào: nếu trên 25 bạch cầu đa nhân và dưới 25 tế bào biểu mô (trên tổng số 100 tế bào ở vi trường), có nhiều khả năng do nhiễm vi khuẩn. Nếu là đờm nên thuần nhất đờm trong 1 - 2ml nước muối sinh lý và dùng máy khuấy làm lỏng đờm trước khi dàn tiêu bản.
Nuôi cấy và phân lập: tùy theo loại bệnh phẩm để có các cách xử lý và nuôi cấy phù
85
Bệnh phẩm đường hô hấp: nếu đặc cần làm lỏng đờm hoặc dịch đường hơ hấp bằng
N-Acetyl-L-Cystine hoặc sputolysin (có tác dụng giải phóng vi khuẩn khỏi các khối đặc của đờm và tế bào). Nên pha lỗng bệnh phẩm ít nhất 10 lần trong nước muối sinh lý trước khi cấy, tốt nhất nên áp dụng phương pháp cấy đếm.
Dịch não tủy: nên cấy song song vào thạch máu 5% và canh thang có bổ sung 5%
máu (thỏ, ngựa, cừu) nhằm mục đích tăng sinh cho vi khuẩn; ủ 370C / 5% CO2; phải cấy chuyển từ canh thang tăng sinh ra thạch máu các ngày thứ 2, 3 và 7 trong trường hợp đĩa thạch máu cấy trực tiếp bệnh phẩm âm tính. Có thể cấy bệnh phẩm lên thạch chocolate hoặc thạch máu thỏ tươi 7%.
Máu: trong trường hợp có sốt hoặc nghi nhiễm khuẩn huyết, cấy máu theo một chu
trình kín vơ khuẩn lấy 3 - 5ml máu tĩnh mạch cấy vào canh thang não - tim (brain - heart infusion) hay canh thang thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang hoặc cho vào chai cấy máu do các hãng sản xuất sẵn, sau đó ủ ở 370C/ 5% CO2 / 18-24 giờ. Nếu dương tính cấy chuyển sang các môi trường thạch (thạch máu 5%, thạch chocolate).
Một số môi trường nuôi cấy phát hiện phế cầu khuẩn:
- Thạch máu 5% có gentamycin (5μg/ml). - Thạch máu 5% khơng có gentamycin. - Thạch máu thỏ 7%.
Ủ ấm trong khí trường 370 C có 5% CO2 từ 18 - 24 giờ. Nếu khơng có tủ ấm CO2, đặt các hộp lồng vào chng thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo được khí trường có CO2, sau đó đặt chng vào tủ ấm 370 C.
Sau 18 - 24 giờ, quan sát trên môi trường thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn nhỏ 0,5 - 1,5mm, có vỏ: nhày ướt, có xu hướng lõm giữa, có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết alpha). Cấy thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ ấm 370C/5% CO2/18 giờ; ngày tiếp theo làm thêm các thử nghiệm sau để xác định (nếu chỉ thấy thuần một loại khuẩn lạc thì khơng cần cấy thuần mà có thể làm ln các bước khẳng định).
Các thử nghiệm xác định: Thử nghiệm Optochin:
86
Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt khoanh giấy optochin d = 6mm (chứa 5μg chất ethylhydrocupreine) lên, ủ ấm 35 - 37OC/5% CO2, sau 18 - 24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy khơng có vịng vơ khuẩn thì đó là Streptococcus viridans. Nếu có vịng vơ khuẩn đường kính ≥ 14mm là dương tính (phế cầu). Nếu vịng vơ khuẩn từ 9 - 13mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật.
Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility):
Từ nuôi cấy thuần và mới (18 - 24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong nước muối sinh lý tương đương độ đục 0,5 Mc Farland.
Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25ml/1 ống), sau đó cho tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25ml muối mật 2% (deoxycholate), lắc nhẹ, ủ 35 - 370C/ 2 giờ.
Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật sau 2 giờ ủ, nếu ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dương tính.
Nếu thực hiện trực tiếp thử nghiệm tan trong muối mật với khuẩn lạc nghi ngờ ở trên thạch máu, phải sử dụng dung dịch sodium deoxycholate 10%, đọc kết quả sau 15 - 20 phút nếu là phế cầu khuẩn, khuẩn lạc sẽ biến mất hoặc dẹt hẳn xuống do bị ly giải, trong khi khuẩn lạc liên cầu không bị muối mật tác động.
Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính:
Dựa trên nguyên lý của phản ứng kết hợp kháng nguyên vỏ của phế cầu với kháng thể đặc hiệu tương ứng tạo sự ngưng kết. Trên thị trường thương mại các sinh phẩm sử dụng cho thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính ln có sẵn, giúp cho việc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải là phế cầu hay không như: bộ kit Slidex Pneumo của Vitek Systems Inc; hay Pneumoslide của BBL Microbiology Systems; Cockeysville, MD; thực hiện thử nghiệm theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Chẩn đoán huyết thanh học:
Hiện nay đã xác định được 90 týp huyết thanh của các chủng phế cầu có vỏ gây bệnh. Người ta xếp thành 9 nhóm kháng huyết thanh đa giá, được ghi theo thứ tự bằng chữ cái in hoa từ A đến I, mỗi nhóm có từ 4 - 7 kháng huyết thanh đơn giá đặc hiệu.
87
Thử nghiệm Quellung: xác định được týp huyết thanh của phế cầu (theo nhóm, hoặc
theo týp đơn).
Phương pháp định týp huyết thanh: gồm các bước
- Nuôi cấy phân lập, thuần nhất vi khuẩn. - Thử nghiệm optochin dương tính.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý hay canh khuẩn trong canh thang BHI có 5% máu, ủ 35 - 370C/5% CO2/ 4 - 8 giờ.
- Có thể bất hoạt vi khuẩn bằng nhỏ vài giọt Formalin vào canh khuẩn trước khi làm phản ứng với kháng huyết thanh.
- Lấy một phiến kính sạch, đặt lên 1 ăng kháng huyết thanh đa giá, sau đó đặt 1 ăng canh khuẩn đã bất hoạt bằng Formalin, trộn đều, rồi lấy 1 lá kính mỏng đậy lên.
- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10 và vật kính 40; điều chỉnh ánh sáng để thấy rõ hiện tượng "phình" của vỏ phế cầu bởi kháng huyết thanh.
- Khi đã có dương tính với kháng huyết thanh đa giá, thử lần lượt với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm, để xác định týp huyết thanh của chủng phế cầu được thử.
Tiêu chuẩn xác định phế cầu:
- Hình thể khuẩn lạc trên mơi trường thạch máu 5% (có hay khơng có gentamycin): nhỏ, ướt, có xu hướng lõm giữa, tan huyết alpha.
- Tính chất vi khuẩn: Song cầu hình ngọn nến hay cặp mắt kính, bắt màu Gram (+) (cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn) nhưng phải:
Nhạy cảm optochin: đường kính vịng vơ khuẩn ≥14mm
Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đường kính vịng vô khuẩn từ 9 - 13mm) nhưng tan trong muối mật.
Không phải là phế cầu khuẩn khi:
- Không nhạy cảm với optochin
- Hoặc có vùng ức chế phát triển bởi optochin với đường kính nhỏ hơn 14mm nhưng không tan trong muối mật.