Bài 13 : HAEMOPHILUS INFLUENZAE
2. Cấu trúc kháng nguyên:
3.2. Đặc điểm nuôi cấy:
Muốn phân lập được H. influenzae, môi trường nuôi cấy giàu chất dinh
dưỡng và cần phải có thêm các yếu tố sau:
Yếu tố X (Heamin): yếu tố này có trong máu (trong huyết tương) và cả trong hồng cầu.
Yếu tố V (NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide): yếu tố này thường chỉ có trong hồng cầu (cũng có thể có trong huyết tương một số động vật nhưng không tồn tại lâu do bị các enzyme ly giải). Muốn có V phải ly giải hồng cầu bằng tăng nhiệt độ (800C). Ngoài ra một số vi sinh vật như tụ cầu vàng cũng có khả năng sản sinh yếu tố V và giải phóng ra mơi trường trong q trình phát triển.
Nhiệt độ phát triển thích hợp: 35 - 370C.
Khí trường thích hợp: 5 - 10% CO2. Nếu khơng có tủ ấm CO2 cần phải sử dụng bình kín đốt nến (sau khi nến tắt, khí trường trong bình có thể có 3% CO2).
H. influenzae có tính đề kháng với bacitracin, do vậy với mục đích chỉ phân
lập H. influenzae, trong mơi trường ni cấy có thể bổ xung bacitracin 300μg/ml để loại bỏ vi khuẩn khác.
Sau 16 - 18 giờ nuôi cấy, H. influenzae phát triển thành các khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1 - 2mm và khơng gây tan huyết. Các chủng có vỏ có thể tạo các khuẩn lạc sáng bóng, nhày ướt và có đường kính lớn hơn. Vi khuẩn thuần nhất có mùi tanh đặc biệt (mùi chuột chù).
93
Bảng 2.1. Phân biệt H. influenzae dựa theo nhu cầu phát triển Loài Tan huyết Cần yếu tố
X Cần yếu tố V Cần CO2 H. influenzae - + + + H. parainfluenzae - - + - H. hemolyticus + + + - H. parahemolyticus + - + ± H. aphrophilus - ± - + 4. Chẩn đốn phịng thí nghiệm: 4.1. Cách lấy bệnh phẩm:
Tuỳ theo thể loại bệnh mà chọn cách lấy bệnh phẩm. Việc phát hiện, xác định chính xác vi khuẩn gây bệnh phụ thuộc vào kỹ thuật lấy bệnh phẩm cũng như quá trình bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm về phịng thí nghiệm. Sau đây là một số phương pháp lấy bệnh phẩm để phát hiện H. influenzae:
4.1.1. Chất dịch đường hô hấp: trong trường hợp viêm phổi, viêm phế quản, viêm phế quản - phổi...
Đờm: nếu là người lớn, đờm được lấy vào buổi sáng sớm, ho và khạc sâu, đờm
được giữ ở hộp vơ khuẩn rồi chuyển về phịng thí nghiệm trong vòng 2 - 6 giờ.
Dịch tỵ hầu: nếu bệnh nhân không khạc được hoặc là trẻ nhỏ dùng tăm bông cán
mảnh mềm lấy chất dịch ở ngã ba mũi - họng theo đường mũi: đưa tăm bông vào sâu bằng một nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra. Chú ý, nếu chưa vào đủ độ sâu đã có vật cản, khơng cố lấy mà phải làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bơng vào khí quản và cán làm bằng kim loại mảnh, mềm không gỉ, không dễ gẫy, khi thực hiện thao tác.
Chất dịch hô hấp lấy bằng máy hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách
ngoáy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch.
Ngoáy họng: đè lưỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ẩm bằng nước muối
94
chạm vào lưỡi, răng, mặt trong má và lưỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bơng vào mơi trường vận chuyển.
4.1.2. Dịch não tuỷ: trong trường hợp nghi viêm màng não, dùng kim chọc tủy sống
vô khuẩn lấy khoảng 2 - 3ml nước não tủy.
4.1.3. Máu: trong trường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não, viêm phổi
cấp, dùng bơm kim tiêm vơ khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch cho ngay vào bình canh thang não - tim (Brain Heart Infusion) hoặc Thioglycolate hoặc glucose 2% theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang; hoặc sử dụng chai cấy máu do các hãng thương mại pha chế sẵn. Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vơ khuẩn trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình mơi trường qua một ống cao su hay plastic vô khuẩn. Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn iốt.
H. influenzae là một vi khuẩn rất nhạy cảm và dễ chết, nhất là khi bệnh phẩm
bị khô hoặc bị lạnh giá; vì vậy, các bệnh phẩm nên được chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng 2 giờ hoặc khơng q 6 giờ ở nhiệt độ phịng thí nghiệm (24- 280C). Nếu là tăm bơng phải giữ trong mơi trường vận chuyển. Có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 80C tối đa 24 giờ trong môi trường vận chuyển.
4.1.4. Các bệnh phẩm khác: lấy mủ amiđan, mủ tai giữa, dịch chọc phổi.
4.2. Quy trình phân lập:
4.2.1. Nhuộm soi:
Nhuộm Gram hoặc Papanicolaou: quan sát hình thể và đánh giá số lượng các tế bào viêm (bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào) và vi khuẩn ở trong và ngoài tế bào theo +, ++, +++.
Đếm tế bào: nếu trên 25 bạch cầu đa nhân và dưới 25 tế bào biểu mô (trên tổng số 100 tế bào ở vi trường) có nhiều khả năng do nhiễm vi khuẩn.
4.2.2. Nuôi cấy và phân lập: tùy theo từng loại bệnh phẩm để có các cách xử lý và
ni cấy phù hợp:
Bệnh phẩm đường hô hấp: nếu đặc cần làm lỏng đờm hoặc dịch đường hô hấp bằng
N - Acetyl - L - Cystine hoặc sputolysin. Nên pha lỗng bệnh phẩm ít nhất 10 lần trong nước muối sinh lý trước khi cấy.
95
Dịch não tủy: cấy song song vừa lên mơi trường thạch chocolate (thạch máu chín),
vừa vào canh thang tăng sinh cho H. influenzae; để nếu vi khuẩn khó mọc trên mơi trường thạch sẽ cấy chuyển tiếp từ canh thang tăng sinh sang thạch chocolate vào các ngày 2, 3 và 7. Sau 7 ngày, nếu vi khuẩn không mọc mới được huỷ bỏ mẫu nuôi cấy.
Máu: cấy trong canh thang, theo dõi hàng ngày nếu dương tính sẽ được cấy chuyển
ra mơi trường thạch chocolate và thạch máu để phân lập tiếp.
Để phân lập được căn nguyên vi khuẩn H. influenzae sử dụng các môi
trường:
Thạch máu 5%.
Thạch chocolate có hoặc khơng có 300μg bacitracin/1ml mơi trường. Thạch máu thỏ tươi 7%.
Ủ ấm trong khí trường 370C có 5% CO2 từ 18 - 24 giờ. Nếu khơng có tủ ấm CO2, đặt các hộp lồng vào chng thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến; khi nến tắt cũng tạo được khí trường có CO2, sau đó đặt chng vào tủ ấm 37oC.
Quan sát thấy các khuẩn lạc của H. influenzae: nhỏ vồng nhẹ, hơi trong, óng ánh khi chiếu sáng, khơng gây tan huyết; cấy thuần lại trên một đĩa thạch chocolate khác, ủ ấm 370C/5% CO2/18 giờ; ngày tiếp theo làm thêm các thử nghiệm để khẳng định (nếu chỉ thấy thuần một loại khuẩn lạc, thì khơng cần cấy thuần, mà có thể làm ln các bước thử nghiệm khẳng định).
4.2.3. Thử nghiệm xác định: Thử nghiệm với yếu tố X và V:
Lấy một đĩa môi trường thạch dinh dưỡng Trypticasein Soya, cấy vi khuẩn
H. influenzae lên bằng cách ria dày theo 3 hướng trên 1 nửa đĩa mơi trường; sau đó,
đặt các khoanh giấy X, V và XV lên, khoảng cách giữa các khoanh giấy 1,5 - 2cm. Ủ ở 370C qua đêm; đọc kết quả dương tính khi thấy vi khuẩn chỉ mọc quanh khoanh giấy XV hoặc chỉ mọc giữa 2 khoanh X và V (có thể hơi lệch về phía X vì V khuếch tán nhanh hơn); do vi khuẩn cần cả 2 yếu tố trong quá trình phát triển. Nếu vi khuẩn chỉ mọc quanh khoanh giấy X là H. aphrophilus. Nếu chỉ mọc quanh
khoanh giấy V là H. parainfluenzae. Nếu chỉ mọc quanh X và V nhưng có vịng tan huyết (trên môi trường thạch chocolate) là H. hemolyticus.
96
Thử nghiệm này có thể thay thế bằng thử nghiệm "vệ tinh" bằng việc sử dụng chủng tụ cầu vàng cấy trên mơi trường thạch máu (tụ cầu vàng có khả năng sinh ra yếu tố V trong quá trình phát triển); khi thấy vi khuẩn mọc quanh đường cấy tụ cầu vàng là dương tính; nhưng phải chú ý cấy một đĩa thạch thường làm chứng âm.
Thử nghiệm porphyrin:
Nhằm xác định chính xác nhu cầu cần yếu tố X của vi khuẩn (loại bỏ các trường hợp yếu tố X có từ mơi trường nuôi cấy ban đầu hoặc các môi trường dùng trong thử nghiệm đã bị nhiễm yếu tố X từ trước hoặc vi khuẩn có khả năng tổng hợp yếu tố X). Lấy 0,5ml ∂-aminolevulinic acid (2mM ∂-aminolevulinic acid hydrochloride - Sigma và 0,8 mM MgSO4 trong 0,1M đệm PBS pH. 6,9 giữ ở 40C) vào trong 1 ống nghiệm vô khuẩn; cấy một ăng đầy vi khuẩn vào, ủ 370C /4 - 24 giờ; đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang; dương tính khi thấy các tế bào vi khuẩn hoặc huyền dịch có màu đỏ.
Cách làm khác: nhỏ 0,5ml thuốc thử Kovac, lắc mạnh và chờ đến khi huyền dịch phân tách thành các lớp; dương tính khi thấy lớp nước ở thấp chuyển màu đỏ hay hồng (chứng tỏ sự có mặt của porphobilinogen).
Xác định týp sinh học của H. influenzae:
Có thể thực hiện phản ứng này bằng các thuốc thử, khoanh giấy hoặc bằng bộ API 10S. Việc định týp sinh học của H. influenzae được dựa trên cơ sở 3 phản ứng sinh hoá chủ yếu là ODC, URE, IND:
ODC: phát hiện hoạt tính của Ornithine decarboxylase: đỏ (+). URE: phát hiện hoạt tính của urease: đỏ (+).
IND: phát hiện sự sản xuất indole: đỏ (+).
Kỹ thuật xác định bằng các thuốc thử ODC, Ure và Indole tự pha lấy: sau khi đã có
các chủng vi khuẩn thuần khiết, dùng 1 pipet Pasteur bẻ cong đầu gặt vi khuẩn (18 giờ ni cấy) hồ đều vào 1ml canh thang BHI hay nước pepton; từ canh khuẩn này cấy vào các ống thử sinh hoá ODC (Ornithine decarboxylase), URE (Urease) và IND (Indole); ủ 370C/5%CO2 qua đêm; đọc kết quả dương tính khi thấy chuyển màu; trước khi đọc Indole nhỏ thuốc thử Kovac.
97
Tạo canh khuẩn trong 1ml nước muối sinh lý có độ đục khoảng 1 - 2 độ đục Mc Faland; tạo hộp ẩm bằng nhỏ vài giọt nước sạch; nhỏ đầy canh khuẩn vào hốc ODC (phát hiện việc sản xuất Ornithine Decarboxylase), URE (phát hiện sự thuỷ phân Urea), IND (phát hiện việc sản xuất indole). Phủ parafin lên bề mặt ODC và URE, ủ qua đêm 370C/ 5% CO2. Đọc kết quả dương tính nếu thấy chuyển màu đỏ ở ODC và URE; nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac vào IND, nếu chuyển màu đỏ cũng là dương tính.
Bảng 2.2. Các týp sinh học của H. influenzae:
Týp sinh học ODC URE IND
I + + + II - + + III - + - IV + + - V + - + VI + - - VII - - + VIII - - -
Týp sinh học của H. influenzae thường liên quan nhiều đến nguồn gốc bệnh phẩm. Đại đa số H. influenzae gây bệnh nhiễm khuẩn xâm lấn (viêm màng não,
nhiễm khuẩn huyết…do H. influenzae typ b) thuộc týp sinh học I (Mỹ, Bắc Âu) và týp sinh học II (Bắc Việt nam). Týp IV thường gây nhiễm trùng sinh dục.
Xác định týp huyết thanh của H. influenzae: ngoài týp sinh học, H. influenzae có vỏ
được phân thành 6 týp huyết thanh khác nhau tùy theo đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide; đánh dấu từ a đến f. 85 - 90% loại H. influenzae có vỏ gây
nhiễm khuẩn nghiêm trọng thuộc týp huyết thanh b.
Vật liệu: Kháng huyết thanh kháng H.influenzae là đa giá, a, b, c, d, e, f;
dung dịch formalin để bất hoạt vi khuẩn (0,5% trong nước muối sinh lý); ống nghiệm sạch, lam kính sạch, ống hút.
Cách làm: lấy 1 ống nghiệm chứa 0,5ml Formalin 0,5%, hoà vào 1 ăng đầy
98
giọt kháng huyết thanh đa giá; trộn đều bằng cách lắc nhẹ phiến kính và quan sát ngay sự ngưng kết bằng mắt thường. Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện các hạt ngưng kết (trong vịng 1 phút); sau đó, thực hiện phản ứng ngưng kết với các týp huyết thanh còn lại (a, b, c, d, e, f); với cách làm tương tự như trên để tìm được týp huyết thanh của vi khuẩn. Nếu không thấy hiện tượng ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá có nghĩa là vi khuẩn thuộc loại khơng định được týp huyết thanh; do đó, khơng cần thực hiện phản ứng với các týp huyết thanh còn lại (đa giá là bao gồm tất cả 6 týp huyết thanh đơn từ a đến f).
Tiêu chuẩn xác định H. influenzae:
- Là cầu trực khuẩn nhỏ mảnh đa dạng, bắt màu Gram (-), khuẩn lạc trong xám nhẹ, óng ánh khi chiếu sáng, khơng gây tan huyết.
- Phát triển thuần nhất trên mơi trường chọn lọc (thạch chocolate có Bacitracin). - Phát triển được cần có đủ yếu tố X và V.
- Định týp sinh học với các phản ứng sinh hóa: ODC, URE và IND. - Định týp huyết thanh: các chủng gây bệnh hầu hết thuộc typ b.
5. Phòng bệnh và điều trị:
5.1. Phòng bệnh:
Phịng khơng đặc hiệu: viêm màng não do H. influenzae týp b là bệnh lây theo đường hơ hấp. Vì vậy, người bệnh phải được cách ly. Người lành tiếp xúc với người bệnh phải được uống kháng sinh dự phòng.
Phòng đặc hiệu: vắc xin thế hệ thứ nhất được tinh chế từ vỏ polysaccharide của H. influenzae týp b. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin này tốt đối với nhóm trẻ
trên hai tuổi; nhưng rất kém ở nhóm tuổi dưới hai tuổi, nhóm mà nguy cơ mắc bệnh cao nhất. Nhược điểm của vắc xin thế hệ thứ nhất là tính sinh miễn dịch kém và khơng tạo được trí nhớ miễn dịch. Vì vậy, vắc xin thế hệ thứ hai được tạo thành do gắn kháng nguyên này vào một protein mang (carrier protein) tạo nên một hỗn hợp có khả năng kích thích miễn dịch qua tế bào lym phơ T. Do đó, tính sinh miễn dịch của polysaccharide được tăng cường và có khả năng lặp được trí nhớ miễn dịch; nên tính sinh miễn dịch tốt hơn vắc xin thế hệ thứ nhất trên nhóm trẻ nhỏ.
99
Ở các nước phát triển, do vắc xin Hib được sử dụng rộng rãi, nên đã ngăn chặn đáng kể viêm đường hô hấp cấp do H. influenzae; nhưng ở các nước đang phát
triển, việc sử dụng vắc xin còn hạn chế; nên sử dụng kháng sinh điều trị là chủ yếu. Từ năm 1945, penicillin được coi là kháng sinh chính dùng cho điều trị H. influenzae; đến năm 1950 khi Chloramphenicol và năm 1961 ampicillin được sử
dụng thay thế. Năm 1974, những trường hợp viêm màng não do H. influenzae
kháng ampicillin lần đầu được ghi nhận. Năm 1976, H. influenzae kháng chloramphenicol cũng được ghi nhận. Các trường hợp kháng cả ampicilin và chloramphenicol được công bố năm 1980 ở Băng Cốc, rồi lan rộng khắp thế giới. Sự đề kháng trimethoprim được ghi nhận từ năm 1987. Cho tới nay, tình hình kháng thuốc của H. influenzae, không chỉ được ghi nhận ở týp b mà còn ở các týp khác.
Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về tính nhạy cảm với kháng sinh của H. influenzae cho thấy: H. influenzae không chỉ kháng lại các kháng sinh thông thường
như: ampicillin, chloramphenicol, co - trimoxazole; mà đã bắt đầu kháng lại các kháng sinh thế hệ mới. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hà và cộng sự năm 1998, xét nghiệm dịch tỵ hầu tìm được 66 chủng
H. influenzae và làm kháng sinh đồ cho thấy: tỷ lệ H.influenzae kháng ampicillin là
18,5%, chloramphenicol là 30,3% và co - trimoxazol là 47%. Theo Đoàn Mai Phương và Nguyễn Xuân Quang mức độ gia tăng tính kháng thuốc của H. influenzae là đáng báo động. Năm 2001 tỷ lệ H. influenzae kháng ampicillin là 12,1%, chloramphenicol là 23% và co - trimoxazole là 14,3%; đến năm 2003 tỷ lệ đó là 36,2%, 53,1% và 61,9%.
6. Liên hệ với thực tế:
H. influenzae là thành viên thuộc hệ vi khuẩn bình thường và gây bệnh có điều
kiện. Trong đó, tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng, nhất là Hib. Chế độ vệ sinh cá nhân, ăn, uống nâng cao thể trạng và thử nghiệm kháng sinh đồ, lựa chọn kháng sinh điều trị là rất cần thiết để hạn chế sự lây lan và di chứng của bệnh.
TỰ LƯỢNG GIÁ:
1. Trình bày vai trị gây bệnh của H. influenza.
2. Trình bày phương pháp chẩn đốn phịng thí nghiệm H. influenza. 3. Trình bày tiêu chuẩn chẩn đoán H. influenza.
100