Các vùng thu mẫu được tô màu đỏ. Tên của tỉnh/thành phố được thể hiện gần vùng tơ đỏ, các con số phía dưới tên tỉnh/thành phố thể hiện lần lượt số lượng mẫu chó
Để an tồn cho người thu mẫu, và dựa trên sự đồng ý của chủ ni chó, lơng đi chó được lựa chọn để thu thập mẫu. Sử dụng kẹp đã rửa sạch bằng cồn 96º để nhổ lấy cả phần gốc của sợi lông. Số lượng sợi lơng thu cho mỗi mẫu ít nhất là 80 sợi, đủ cho hai lần tách chiết DNA. Ở thực địa, lơng chó được trữ trong các túi ny- lơng riêng biệt có khóa kéo và đưa về phịng thí nghiệm. Sau đó, lơng chó được cắt ngắn khoảng 1 cm tính từ gốc, rửa bằng nước cất vơ trùng, cho vào eppendorf 1,5 ml và giữ mẫu ở nhiệt độ -30ºC cho đến khi sử dụng.
2.2.2.3. Tách chiết DNA tổng số từ lơng chó
DNA được tách chiết bằng phương pháp sử dụng Phenol:Chloroform [39], [69], phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm sinh học phân tử thơng thường. Quy trình tách chiết được xây dựng bao gồm hai bước ủ với dung dịch ly giải nhằm nâng cao hiệu quả phá vỡ màng tế bào, màng nhân. Đầu tiên, màng tế bào sẽ được phá vỡ bằng các chất tẩy SDS, Triton X100 có trong dung dịch ly giải. Sau khoảng chừng 20 phút, proteinase K được thêm vào nhằm phân hủy các protein nội bào. Các điều kiện của quá trình tách chiết DNA cần được khảo sát bao gồm thời gian ủ mẫu, nhiệt độ ủ mẫu, và muối dùng trong tủa DNA.
Theo các nghiên cứu trước đây, nhiệt độ ủ mẫu với proteinase K thường là 50oC [80], 56oC [15], [58], hay 65oC [32] trong nhiều khoảng thời gian khác nhau. Theo khuyến cáo từ nhà sản xuất (Fermentas), proteinase K đang được sử dụng hoạt động tốt trong khoảng từ 50 đến 65oC và thời gian từ 40 đến 60 phút. Vì vậy, các mốc nhiệt độ 50oC, 56oC và 65oC được khảo sát nhằm xác định nhiệt độ ủ mẫu thích hợp nhất trong kỹ thuật tách chiết DNA. Ở nhiệt độ thích hợp nhất, hai khoảng thời gian ủ mẫu với proteinase K là 40 phút và 60 phút cũng được thử nghiệm và đánh giá. Sau khi được phân tách ra khỏi các thành phần không mong muốn bằng hỗn hợp phenol:chloroform, DNA sẽ được tủa bằng ethanol tuyệt đối lạnh với sự có mặt của muối natri acetate (NaOAc) 0,3M hoặc NaCl 0,2M. Trong các thí nghiệm khảo sát, số lượng sợi lông sử dụng là 40 sợi. Riêng trong trường hợp so sánh khả năng tủa DNA với hai loại muối khác nhau, 80 sợi lông được sử dụng để nâng cao
nồng độ DNA thu được. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, các điều kiện khảo sát được tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1: Nội dung và điều kiện khảo sát quy trình tách chiết DNA
Nội dung khảo sát Điều kiện khảo sát
Nhiệt độ ủ mẫu 50oC 56oC 65oC Thời gian ủ mẫu 40 phút 60 phút Muối dùng để tủa DNA NaOAc 0,3M NaCl 0,2M
DNA thu được trong các điều kiện khảo sát khác nhau sẽ được so sánh, đánh giá thông qua điện di trên gel agarose 1%, tỷ số OD260nm/OD280nm và khả năng sử dụng được trong các phản ứng PCR tiếp sau đó. Độ sáng của các băng DNA sẽ được xác định và so sánh bằng phần mềm ImageJ2 [66]. Chương trình này sẽ phân tích hình ảnh của bảng gel điện di và thể hiện độ đậm của vùng khảo sát bằng đồ thị, với độ sáng của các băng DNA tương ứng với độ cao của các đỉnh (peak) trên đồ thị. Vùng diện tích dưới mỗi đỉnh, sau khi trừ đi tín hiệu nền, được xem là giá trị đại diện độ sáng của băng DNA trên bảng gel. Để dễ dàng trong việc so sánh độ sáng băng DNA, các giá trị này được quy về thành phần phần trăm (%) tổng độ sáng của các băng DNA khảo sát.
Mỗi mẫu chứa 40 sợi lơng chó với độ dài khoảng 1 cm tính từ gốc được lắc (vortex) trong 30 giây rồi ủ trong dung dịch ly giải (Tris-HCl 10 mM, pH 8; Triton X100 1%; SDS 1%; EDTA 10 mM) ở nhiệt độ thích hợp trong 20 phút để phá màng tế bào. Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), lắc trong 30 giây rồi ủ ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp để tăng cường hiệu quả phá vỡ cấu trúc keratin và các protein khác. Tiếp tục bổ sung 100 μl dung dịch ly giải và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp nhằm giải phóng DNA triệt để. Pha nước chứa DNA sẽ được phân tách bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). DNA trong dịch nổi được tủa bằng muối và ethanol tuyệt đối lạnh, ủ mẫu ở -30ºC trong 30 phút để đạt hiệu quả tối đa. Ly tâm thu tủa và rửa bằng ethanol 70º lạnh. Sau khi làm khơ, DNA được hồ với 30 μl nước cất vơ trùng và bảo quản ở -30ºC (Hình 2.6).