CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.4. Đọc và biên tập trình tự nucleotide
Cặp mồi 15412F-16114R hoạt động không hiệu quả trong phản ứng PCR khi sử dụng DNA tổng số làm nguyên liệu nhưng hoạt động tốt khi thử nghiệm sử dụng sản phẩm PCR làm nguyên liệu. Sản phẩm PCR cho tín hiệu rõ đẹp trên gel agarose 1% qua quá trình điện di. Vì vậy, cặp mồi này được sử dụng cho phản ứng giải trình tự.
Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm FinchTV. Những mẫu có kết quả giải trình tự cho tín hiệu khơng rõ ràng sẽ được giải trình tự lại, nếu kết quả giải trình tự lần hai vẫn cho tín hiệu khơng tốt sẽ bị loại khỏi các mẫu khảo sát. Ở mỗi mẫu, hai trình tự nucleotide được đọc bằng mồi 15412F và 16114R sẽ được so sánh với nhau để kiểm chứng. Trình tự cuối cùng được khẳng định bởi cả hai mồi sẽ là trình tự nucleotide của mẫu tương ứng. Hai trăm mẫu DNA khảo sát trong đề tài là những mẫu có kết quả giải trình tự rõ ràng, đặc biệt là ở vùng trình tự 582 cặp base cần phân tích. Mỗi trình tự này khi được so sánh với các trình tự trong cơ sở dữ liệu GenBank [13] bằng chương trình BLAST [8] đều cho kết quả tương đồng rất cao với các trình tự DNA ty thể của chó nhà. Kết quả này cho phép khẳng định rằng các trình tự DNA ty thể của các mẫu chó được sử dụng trong nghiên cứu này đã được khuếch đại thành cơng.
Lấy mẫu VD22 làm ví dụ, đây là mẫu mà các phân tích sau này xác định là một haplotype thuộc haplogroup C mang một đột biến mới (A biến đổi thành G tại vị trí 15613). Hình 3.9 là một phần kết quả giải trình tự của mẫu VD22 này, với nửa trên là trình tự với được đọc với mồi 15412F và nửa dưới là trình tự đảo ngược bổ sung (reverse complement) của trình tự được đọc với mồi 16614R. Đoạn trình tự được thể hiện trong hình là đoạn khoảng chừng 40 nucleotide bao gồm vị trí 15613 (được đánh dấu mũi tên). Cả hai kết quả giải trình tự đều cho kết quả rõ, đẹp, khơng có tín hiệu nhiễu và đều khẳng định vị trí 15613 là một guanine. Các phân tích sau này cho thấy đột biến A15613G này là một vị trí đột biến mới, chưa từng được phát hiện trên thế giới.
Hình 3.9: Một đoạn kết quả giải trình tự mẫu VD22
Hai trăm trình tự sau khi được giải mã, biên tập, và tách thông tin vùng 582 cặp base đã được nộp lên ngân hàng gen GenBank. Sau khi được kiểm tra và chứng