1.4.2. Các nghiên cứu di truyền hiện đại
1.4.2.1. Các chỉ thị phân tử được dùng trong nghiên cứu
Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các chỉ thị phân tử (marker) như RNA ribosome, DNA ty thể, DNA lạp thể, các đoạn trình tự lặp lại (STR - short tandem repeat, VNTR, …), nhiễm sắc thể giới tính Y,… ngày càng được nghiên cứu sâu, trở thành cơng cụ đắc lực giúp tìm hiểu nguồn gốc tiến hố và mối quan hệ di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loài, giúp hiểu rõ hơn về quá trình hình thành và phát triển của sinh giới [21], [22]. Việc phát hiện ra đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể cũng đã mở ra một hướng nghiên cứu đầy triển vọng. DNA ty thể được sử dụng để phân tích các mối quan hệ tiến hoá và biến đổi di truyền trong lồi và giữa các lồi theo dịng mẹ [37], [56].
Ở chó, nhiều chỉ thị phân tử khác nhau đã được sử dụng để tìm hiểu về đa dạng di truyền và nguồn gốc của các giống chó. Tanabe và cộng sự khảo sát sự đa hình của gen mã hóa các protein máu ở chó vùng Đơng Á để tìm hiểu mối quan hệ di truyền giữa các giống chó này [85]. Dữ liệu phân tích cho thấy rằng từ thời kỳ đồ đá mới (thời Jomon từ 14.000 đến 400 trước cơng ngun (TrCN)) các con chó đầu tiên từ phía Nam và phía Bắc của châu Á đã xâm nhập vào Nhật Bản sau đó lan khắp Nhật Bản. Đến thời Yayoi (từ 300 đến 250 TrCN) và thời Kofun (250 TrCN đến 580 SCN) những dịng chó khác đã xâm nhập vào Nhật Bản qua bán đảo Triều Tiên, tại đây chúng giao phối với chó bản địa để tạo nên sự đa dạng của các giống chó Nhật Bản ngày nay. Tuy nhiên, do tốc độ đột biến của các trình tự này rất thấp, các gen này thích hợp để nghiên cứu mối quan hệ giữa các giống chó có mối quan hệ di truyền xa nhau, cịn giữa các giống chó có mối quan hệ di truyền gần gũi, hầu như có rất ít sự sai khác trong trình tự các gen này. Sự đa hình của trình tự lặp lại (GAAA)n [23] trên DNA trong nhân của 11 giống chó bản địa ở Đơng Á cho thấy các giống chó Sapsaree và Jindo (Hàn Quốc) có mối quan hệ di truyền gần gũi và gần với chó Eskimo, gợi ý rằng các giống chó Hàn Quốc này có nguồn gốc từ vùng Viễn Đơng [38]. Sự đa hình của các siêu tiểu vệ tinh AHT121, AHTh171, AHTk211, AHTk253, AHTh260, CXX279, FH2054, INRA21, REN162C04 và
REN54P11 trên DNA trong nhân cũng cho thấy mối quan hệ di truyền gần gũi giữa chó Donggyeong và chó Jindo (Hàn Quốc) [46]. Nghiên cứu của Kang và cộng sự cũng chứng minh sự gần gũi về mặt di truyền giữa 5 giống chó bản địa Hàn Quốc dựa trên sự đa hình của 14 siêu tiểu vệ tinh PEZ8, FCH2164, FCH2132, FCH2131, FCH2152, FCH2004, FCH2161, FCH2175, FCH2258, FCH2360, FCH2016, FCH2097, PEZ3, FCH2201. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng sự đa hình của các chỉ thị phân tử này thích hợp cho việc xác định mối quan hệ huyết thống giữa các cá thể chó khảo sát [36]. Sự đa dạng di truyền của DNA nằm trên nhiễm sắc thể thường trong các nghiên cứu trước đây thường khơng cung cấp đủ thơng tin để tìm hiểu về nguồn gốc của các giống chó hoặc mối quan hệ giữa các giống chó có khoảng cách di truyền xa nhau [38], [46], [85], mà chủ yếu để xác định quan hệ huyết thống giữa các cá thể chó [7], [19], [35], [36].
Sự đa dạng di truyền của nhiễm sắc thể giới tính Y cung cấp nhiều thơng tin hơn trong việc tìm hiểu nguồn gốc hình thành lồi chó. Bằng cách khảo sát và so sánh sự đa dạng di truyền của nhiễm sắc thể Y trong quần thể chó sói ở Ý và ở chó, Iacolina và cộng sự đã chứng minh về khả năng giao phối giữa chó sói cái và chó đực trong q trình sống [33]. Ding và cộng sự đã khảo sát sự đa dạng di truyền của vùng trình tự dài 14437 cặp base trên nhiễm sắc thể Y của 151 con chó trên thế giới để xác định được địa điểm bắt đầu hình thành lồi chó nhà hiện nay nằm ở phía Nam sơng Dương Tử [18].
Trong thực tế, cũng như trong các nghiên cứu về nguồn gốc loài người và nhiều loài động vật khác, việc sử dụng chỉ thị phân tử là DNA ty thể trong các nghiên cứu về nguồn gốc lồi chó có nhiều ưu thế [17]. Một trong những ưu thế đó là DNA ty thể tồn tại với số lượng lớn, có thể lên đến vài ngàn phân tử trong mỗi tế bào nên DNA ty thể vẫn có thể được thu thập được từ những mẫu vật tồn tại từ lâu đời trong khi DNA hệ gen đã bị phân hủy hết. Thậm chí từ một mẫu xương của sinh vật giống với chó tồn tại cách đây 33600 năm, người ta đã tách chiết và giải trình tự được hầu như nguyên vẹn (98,6%) DNA ty thể (mã số GenBank KF661079). Ngồi một số ít cơng trình sử dụng trình tự gen CytB, gen tRNA-Thr, gen tRNA-Pro [47],
COI [48] để khảo sát tính đa dạng di truyền làm cơ sở xác định nguồn gốc của chó Ngao Tây Tạng, hầu hết nghiên cứu trên DNA ty thể ở chó chủ yếu tập trung vào vùng CR (Control region – vùng kiểm soát) của DNA ty thể. Trình tự HV2 của vùng CR cũng được sử dụng nghiên cứu [92] nhưng do tốc độ đột biến quá chậm so với HV1, các nghiên cứu đa dạng trên vùng CR thường chỉ nghiên cứu trên đại diện là vùng HV1. Baute xác định đoạn trình tự 60 cặp base từ nucleotide 15595 đến 15654 là vùng có mức độ đa hình cao trong DNA ty thể, chứa đến 1/3 tổng số các vị trí đa hình trên tồn bộ vùng HV1 [11]. Mở rộng vùng trình tự này, Vila và cộng sự khảo sát đoạn 261 cặp base thuộc vùng HV1 của DNA ty thể [93], [95] để khảo sát mối quan hệ di truyền giữa chó nhà và chó sói nhằm xác định nguồn gốc của chó nhà. Masuda và cộng sự thì chọn đoạn trình tự 215 cặp base (từ nucleotide 15465 đến 15679) của vùng HV1 DNA ty thể để khảo sát sự đa dạng di truyền của những con chó thời Jomon ở Nhật Bản (16500 đến 2800 trước) [49]. Kế thừa thông tin về sự đa dạng di truyền trong vùng HV1 của các nghiên cứu trước đó, Savolainen đã mở rộng vùng khảo sát lên đến 582 cặp base (từ nucleotide 15458 đến 16039) [74]. Đoạn trình tự 582 cặp base này nhanh chóng được chấp nhận là trình tự đại diện cho toàn bộ vùng CR và được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu liên quan đến nguồn gốc của chó nhà nói chung [55] hay của các giống chó khác nhau như chó vùng Madagasca [9], chó bản địa Hoa Kỳ [91], các giống chó ở Bồ Đào Nha [90], ở Thổ Nhĩ Kỳ [42] hay chó Ngao Tây Tạng [63]… Hàng ngàn đoạn 582 cặp base đã được giải trình tự và cơng bố trên GenBank.
Việc mở rộng vùng trình tự khảo sát cũng mang lại nhiều thơng tin hơn trong nghiên cứu về nguồn gốc hình thành lồi chó. Pang và cộng sự đã nghiên cứu trên tồn bộ hệ gene ty thể của 169 con chó [55], Wang và cộng sự thậm chí đã nghiên cứu trên tồn bộ hệ gene của 46 con chó cùng 12 con chó sói để tìm hiểu về nguồn gốc tiến hóa, thời điểm và địa điểm thuần hóa của chó [96]. Dữ liệu thu thập được trên toàn bộ hệ gene là các chứng cứ di truyền vững chắc cho phép khẳng định thêm các nhận định về địa điểm thuần hóa của chó, tương tự như những nghiên cứu dựa trên nhiễm sắc thể Y hay DNA ty thể trước đó. Dù cung cấp nhiều thơng tin hơn,
việc giải trình tự tồn bộ hệ gen DNA ty thể (khoảng 16727 cặp base) hay toàn hệ gen chó (khoảng 2,8 tỉ cặp base) rất tốn kém là một trở ngại lớn trong các nghiên cứu. Vì vậy, hiện nay, khơng có nhiều nghiên cứu sử dụng các đối tượng DNA này.
1.4.2.2. Nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa của chó nhà
Sau khi tồn bộ trình tự hệ gen ty thể chó được cơng bố vào năm 1998 [37], nhiều cơng trình nghiên cứu đã được tiến hành trên vùng CR nhằm xác định đa dạng di truyền và mối quan hệ chủng lồi của các quần thể chó trên thế giới [29], [98]. Từ đó đến nay, hàng nghìn trình tự vùng CR được đăng ký trên ngân hàng dữ liệu GenBank góp phần giúp hiểu rõ hơn về q trình thuần hóa cũng như mối quan hệ di truyền giữa các giống chó nói riêng và với các nhóm động vật khác nói chung. Trình tự nucleotide vùng HV1 thuộc vùng CR ở DNA ty thể của chó rất đa dạng với nhiều đột biến DNA khác nhau, bao gồm cả đột biến mất hoặc thêm các nucleotide. Mỗi trình tự nucleotide riêng biệt này được gọi là một haplotype. Bằng cách xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên đoạn trình tự 582 cặp base vùng HV1 của 654 cá thể chó đại diện cho hầu hết các giống chó trên tồn thế giới, Savolainen và cộng sự (2002) nhận thấy các haplotype này cùng với các haplotype của chó sói phân bố thành 6 nhóm và được đặt tên lần lượt là các haplogroup A, haplogroup B, haplogroup C, haplogroup D, haplogroup E và haplogroup F [74] (Hình 1.7). Nghiên cứu của Pang và cộng sự (2009) cũng ghi nhận tương tự khi khảo sát trên số lượng mẫu lớn hơn, lên đến 1543 cá thể chó [55]. Điều đó cho thấy sự khác biệt về hình thái của các giống chó trên thế giới khơng phải là kết quả của q trình thuần hóa chó sói ở từng khu vực địa lý khác nhau mà do quá trình di cư và quá trình giao phối giữa các giống với nhau. Cũng theo kết quả khảo sát, có 72,34% chó trên thế giới thuộc haplogroup A; 97,40% chó thuộc haplogroup A, B hoặc C. Cả 3 haplogroup A, B và C phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, riêng haplogroup C khơng có ở châu Mỹ. Ngược lại, haplogroup D, E và F được xác định là các nhóm hiếm bởi vì chưa có đến 3% số cá thể chó trên thế giới tìm thấy thuộc những nhóm này; trong đó, haplogroup E và F chỉ chiếm khoảng 1 – 2%. Thay vì phân bố rộng khắp các khu vực địa lý như các haplogroup A, B và C, các haplotype
thuộc haplogroup D, E và F chỉ được phát hiện ở những vùng tương đối hạn hẹp; chẳng hạn như haplogroup D được tìm thấy ở Thổ Nhĩ Kỳ, Tây Ban Nha và vùng Scandinavi [40]; haplogroup E được tìm thấy ở Siberia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Indonesia, Thái Lan và Việt Nam [40], [54], [55] cịn haplogroup F được tìm thấy ở Nhật Bản [55].
Hình 1.7: Các haplotype của DNA ty thể chó gom thành 6 haplogroup A, B, C, D, E, F trên cây tiến hóa.
Tên các haplotype đã được lược bỏ. Các nhóm A, B, C được đóng khung tơ màu xanh để dễ phân biệt với các nhóm xem kẽ là D, E, F. Nhóm coy là các haplotype của chó sói đồng cỏ (coyote) được sử dụng làm nhóm ngoại. (Nguồn: Pang và cs.,
Giả thuyết chó nhà có nguồn gốc từ chó sói xám đã được thừa nhận từ các nghiên cứu khảo cổ học cũng như về di truyền học. Tuy nhiên, thời điểm và địa điểm thuần hóa của chó nhà vẫn cịn nhiều tranh cãi với nhiều giả thuyết khác nhau. Nhiều DNA marker khác nhau, bao gồm cả DNA ty thể đã được chọn làm nguồn nguyên liệu để khai thác thông tin làm rõ các giả thuyết này. Shannon và cộng sự nghiên cứu DNA trong nhân và DNA ty thể của 4676 con chó thuộc 38 quốc gia và nhận định rằng chó nhà có nguồn gốc từ Trung Á [76]. Vila và cộng sự (1997) đã tiến hành phân tích đoạn trình tự 261 cặp base vùng HV1 của 162 con chó sói tại 27 quốc gia trên thế giới và 140 con chó nhà đại diện cho 67 giống. Kết quả nghiên cứu cho thấy chó nhà và chó sói có 26 haplotype khác nhau, trong đó có 12 vị trí đa hình giống nhau. Điều này giúp tác giả đưa ra giả thuyết chó nhà có nguồn gốc từ chó sói cách đây hơn 100.000 năm [95]. Tuy nhiên, Savolainen và cộng sự (2002) lại bác bỏ giả thuyết trên, nhóm nghiên cứu đã dựa vào đoạn trình tự 582 cặp base vùng HV1 (từ nucleotide 15458 đến nucleotide 16039 của DNA ty thể) của 654 con chó nhà đại diện cho các giống chó lớn trên thế giới và nhận thấy rằng chó nhà khu vực Đơng Á có nguồn gốc từ một ổ gen duy nhất từ chó sói cách đây khoảng 15.000 năm [74]. Theo Pang và cộng sự (2009), các nghiên cứu trước đó của Vila và cộng sự (1997) [95], Savolainen và cộng sự (2002) [74] đã thất bại trong việc xác định thời gian, nguồn gốc của chó nhà vì số lượng mẫu nghiên cứu ít nên chưa thể đánh giá và đưa ra kết luận chính xác ở mức độ tồn cầu. Kết quả nghiên cứu toàn bộ hệ gen ty thể của 169 con chó và vùng CR của 1543 con chó khắp cựu lục địa cho thấy chó nhà được thuần hóa từ cách đây khoảng 16300 năm từ khoảng vài trăm con sói cái [55]. Nghiên cứu gần đây của Wang và cộng sự (2016) dường như đã tiến gần hơn đến việc xác minh nguồn gốc của chó nhà. Bằng việc phân tích tồn bộ hệ gen của chó, nhóm tác giả cũng ghi nhận về thời điểm chó nhà được thuần hóa tương tự như các nghiên cứu trước đây, và bản đồ di cư của chó cũng dần được định rõ. Theo đó, chó nhà được thuần hóa ở vùng Đơng Nam Á cách đây khoảng 33000 năm. Đến khoảng 15000 trước, một nhóm chó đã bắt đầu di cư đến Trung Đơng, châu Phi và tiến đến châu Âu khoảng chừng 10000 năm trước. Tại vùng Trung Đơng, một nhóm
chó đã di cư ngược lại về phía đơng, giao phối cùng với nhóm chó châu Á địa phương tạo nên quần thể pha trộn di truyền ở phía Bắc Trung Hoa trước khi di cư đến tân lục địa (Hình 1.8) [96]. Nghiên cứu cũng để lại nhiều câu hỏi mở cần được giải đáp về q trình di cư của chó trong nội vùng châu Phi cũng như trong tân lục địa.