A: Khảo sát các nhiệt độ ủ mẫu khác nhau (giếng 3: 50oC, giếng 4: 56oC, giếng 5: 65oC ); B: khảo sát các thời gian ủ mẫu khác nhau (giếng 2: 60 phút, giếng 3: 40 phút, giếng 4: mẫu chứng âm); C: so sánh khả năng tủa DNA của NaOAc (giếng 2)
Trong các thí nghiệm so sánh sự tủa DNA bằng hai loại muối khác nhau, các mẫu lơng chó được ủ với proteinase K ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 60 phút. DNA được giải phóng sẽ được phân tách với các thành phần khác của tế bào như protein, các mảnh vỡ tế bào bằng hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol và được tủa bằng ethanol tuyệt đối lạnh với hai loại muối khác nhau: NaOAc 0,3M và NaCl 0,2M. Tín hiệu điện di DNA trong trường hợp tủa với muối NaOAc sáng rõ hơn nhiều so với trường hợp tủa với muối NaCl (Bảng 3.8 và Hình 3.4, C). Kết quả đo OD cho thấy các sản phẩm đều có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,74 đến 1,8 cho thấy DNA thu được có độ tinh sạch tốt. Nồng độ DNA thu được trong trường hợp tủa bằng muối NaOAc cao hơn gấp đôi so với tủa bằng muối NaCl (8,1 ng/μl so với 3,25 ng/μl). Tuy nhiên, dù cho nồng độ DNA thu được khi tủa bằng muối NaOAc khá cao nhưng những phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự HV1 sử dụng DNA tách chiết được làm nguyên liệu lại cho kết quả không ổn định. Thử nghiệm PCR trên 30 mẫu DNA tách chiết thì chỉ có 14 mẫu được khuếch đại thành cơng. Trong khi đó, các phản ứng PCR lại cho kết quả thành công 100% (30/30 mẫu) với DNA tủa bằng muối NaCl. Có thể các hóa chất được sử dụng trong tách chiết, đặc biệt là SDS, cịn sót lại trong sản phẩm DNA đã ức chế phản ứng PCR. NaCl đã giữ cho SDS tan trong pha nước [30], không bị tủa và lắng cùng với DNA qua quá trình ly tâm.
Bảng 3.8: So sánh DNA thu được khi tủa bằng muối NaOAc và NaCl Muối Muối NaOAc NaCl Độ sáng băng DNA Lần 1 38,2 24,3 Lần 2 38,8 28,4 Lần 3 35,2 23,9 Trung bình 37,4 ± 1,93 25,5 ± 2,5 OD260/OD280 Lần 1 1,78 1,77 Lần 2 1,74 1,82 Lần 3 1,8 1,77 Trung bình 1,77 ± 0,03 1,79 ± 0,03
Tổng hợp các điều kiện khảo sát, quy trình tách chiết DNA được tiến hành như sau: Mỗi mẫu chứa 40 sợi lơng chó với độ dài khoảng 1 cm tính từ gốc được lắc trong 30 giây với 200 μl dung dịch ly giải (Tris-HCl 10 mM, pH 8; Triton X100 1%; SDS 1%; EDTA 10 mM) rồi ủ ở 50oC trong 20 phút để phá màng tế bào. Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), lắc 30 giây rồi ủ ở 50o
C trong 60 phút để tăng cường hiệu quả phá vỡ cấu trúc keratin và các protein khác. Tiếp tục bổ sung 100 μl dung dịch ly giải và ủ tiếp ở 50oC trong 20 phút nhằm giải phóng DNA triệt để. Pha nước chứa DNA sẽ được phân tách bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). DNA trong dịch nổi được tủa bằng NaCl 3M (nồng độ NaCl ở dung dịch cuối là 0,2M) và ethanol tuyệt đối lạnh, ủ mẫu ở -30ºC trong 30 phút để đạt hiệu quả tối đa. Ly tâm thu tủa và rửa bằng ethanol 70º lạnh. Sau khi làm khô, DNA được hồ với 30 μl nước cất vơ trùng và bảo quản ở -30ºC (Hình 3.5).