Nội dung khảo sát Điều kiện khảo sát
Nhiệt độ ủ mẫu 50oC 56oC 65oC Thời gian ủ mẫu 40 phút 60 phút Muối dùng để tủa DNA NaOAc 0,3M NaCl 0,2M
DNA thu được trong các điều kiện khảo sát khác nhau sẽ được so sánh, đánh giá thông qua điện di trên gel agarose 1%, tỷ số OD260nm/OD280nm và khả năng sử dụng được trong các phản ứng PCR tiếp sau đó. Độ sáng của các băng DNA sẽ được xác định và so sánh bằng phần mềm ImageJ2 [66]. Chương trình này sẽ phân tích hình ảnh của bảng gel điện di và thể hiện độ đậm của vùng khảo sát bằng đồ thị, với độ sáng của các băng DNA tương ứng với độ cao của các đỉnh (peak) trên đồ thị. Vùng diện tích dưới mỗi đỉnh, sau khi trừ đi tín hiệu nền, được xem là giá trị đại diện độ sáng của băng DNA trên bảng gel. Để dễ dàng trong việc so sánh độ sáng băng DNA, các giá trị này được quy về thành phần phần trăm (%) tổng độ sáng của các băng DNA khảo sát.
Mỗi mẫu chứa 40 sợi lơng chó với độ dài khoảng 1 cm tính từ gốc được lắc (vortex) trong 30 giây rồi ủ trong dung dịch ly giải (Tris-HCl 10 mM, pH 8; Triton X100 1%; SDS 1%; EDTA 10 mM) ở nhiệt độ thích hợp trong 20 phút để phá màng tế bào. Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), lắc trong 30 giây rồi ủ ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp để tăng cường hiệu quả phá vỡ cấu trúc keratin và các protein khác. Tiếp tục bổ sung 100 μl dung dịch ly giải và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp nhằm giải phóng DNA triệt để. Pha nước chứa DNA sẽ được phân tách bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). DNA trong dịch nổi được tủa bằng muối và ethanol tuyệt đối lạnh, ủ mẫu ở -30ºC trong 30 phút để đạt hiệu quả tối đa. Ly tâm thu tủa và rửa bằng ethanol 70º lạnh. Sau khi làm khơ, DNA được hồ với 30 μl nước cất vơ trùng và bảo quản ở -30ºC (Hình 2.6).
Hình 2.6: Quy trình tách chiết DNA
Các công việc tách chiết DNA, điện di trong đề tài được tiến hành với các hóa chất thơng dụng trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử, chẳng hạn như phenol, chloroform, NaCl 3M, cồn tuyệt đối... (Phụ lục 1). Các hóa chất được pha ở nồng độ cao (dung dịch mẹ), được vô trùng bằng hơi nước ở 120oC, 1 atm (hầu hết các hóa chất) hoặc lọc bằng màng lọc 0,2 μm (dung dịch SDS). Các dung dịch mẹ
này được lưu trữ ở nhiệt độ thích hợp và được pha đến nồng độ sử dụng trong phịng thí nghiệm bằng nước cất hai lần vô trùng.
2.2.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng quang phổ kế
Các mẫu DNA sau khi được tách chiết DNA sẽ được xác định độ tinh sạch và nồng độ bằng máy đo mật độ quang Genova Plus. Các chỉ số OD của DNA được đo ở các bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm và 320 nm.
Độ tinh sạch của mẫu DNA thu được dựa trên tỷ số OD260nm/OD280nm và OD260nm/OD230nm. Dung dịch nucleic acid được xem là sạch, không tạp nhiễm khi tỷ số OD260nm/OD280nm trong khoảng 1,8 – 2,0 và tỷ số OD260nm/OD230nm trong khoảng 2,0 – 2,2. OD320nm được xem là tín hiệu nền của các mẫu khảo sát.
Tỷ số OD được tính theo cơng thức do nhà sản xuất Genova cung cấp:
OD260/280 =
OD260/230 =
Cách tính nồng độ DNA trong dung dịch khi đo quang: CDNA (ng/µl) = (OD260nm – OD320nm) x 50 Trong đó:
CDNA: nồng độ của DNA trong dung dịch (ng/µl). OD230: Giá trị OD đo được ở bước sóng 230 nm. OD260: Giá trị OD đo được ở bước sóng 260 nm. OD280: Giá trị OD đo được ở bước sóng 280 nm. OD320: Giá trị OD đo được ở bước sóng 320 nm.
DNA tinh sạch được bảo quản trong nước ở -30 ºC đến khi sử dụng.
2.2.2.5. Khuếch đại trình tự vùng HV1 bằng phản ứng PCR
Các phản ứng PCR trong đề tài được tiến hành với Prime Taq Premix G2000 (GeNet Bio – Hàn Quốc), trong đó, các thành phần chung như DNA polymerase, dung dịch đệm, MgCl2, các nucleotide đã được pha sẵn. Các mồi dùng trong phản
ứng PCR và giải trình tự nucleotide được tổng hợp bởi cơng ty IDT (Mỹ).
Vùng HV1 DNA ty thể của các mẫu khảo sát được khuếch đại với các mồi 15412F và 16625R (Bảng 2.2 và Hình 2.7) theo nghiên cứu của Gundry và cộng sự [26]. Các mẫu DNA tách chiết được khuếch đại số lượng với thành phần phản ứng PCR bao gồm master mix với tên thương phẩm Prime Taq Premix (2X) của hãng
GenetBio – Hàn Quốc (0,1U/µl Taq DNA Polymerase; 0,4 mM dNTP; 4 mM
MgSO4; 20 mM KCl; 16 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl, pH8,8); 1 µl mồi xi (15412F, 10 µM); 1 µl mồi ngược (16625R, 10 µM); 2 µl DNA mẫu; nước cất vơ trùng vừa đủ 20 µl [26]. Chương trình PCR gồm các bước như sau:
- Giai đoạn biến tính (1 chu kỳ): 95ºC trong 5 phút - Giai đoạn chính (35 chu kỳ):
+ biến tính ở 95ºC trong 30 giây + mồi bắt cặp ở 49ºC trong 30 giây
+ tổng hợp mạch DNA mới ở 72ºC trong 1 phút