mẫu lơng chó được ủ với proteinase K ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 60 phút. DNA được giải phóng sẽ được phân tách với các thành phần khác của tế bào như protein, các mảnh vỡ tế bào bằng hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol và được tủa bằng ethanol tuyệt đối lạnh với hai loại muối khác nhau: NaOAc 0,3M và NaCl 0,2M. Tín hiệu điện di DNA trong trường hợp tủa với muối NaOAc sáng rõ hơn nhiều so với trường hợp tủa với muối NaCl (Bảng 3.8 và Hình 3.4, C). Kết quả đo OD cho thấy các sản phẩm đều có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,74 đến 1,8 cho thấy DNA thu được có độ tinh sạch tốt. Nồng độ DNA thu được trong trường hợp tủa bằng muối NaOAc cao hơn gấp đôi so với tủa bằng muối NaCl (8,1 ng/μl so với 3,25 ng/μl). Tuy nhiên, dù cho nồng độ DNA thu được khi tủa bằng muối NaOAc khá cao nhưng những phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự HV1 sử dụng DNA tách chiết được làm nguyên liệu lại cho kết quả không ổn định. Thử nghiệm PCR trên 30 mẫu DNA tách chiết thì chỉ có 14 mẫu được khuếch đại thành cơng. Trong khi đó, các phản ứng PCR lại cho kết quả thành công 100% (30/30 mẫu) với DNA tủa bằng muối NaCl. Có thể các hóa chất được sử dụng trong tách chiết, đặc biệt là SDS, cịn sót lại trong sản phẩm DNA đã ức chế phản ứng PCR. NaCl đã giữ cho SDS tan trong pha nước [30], không bị tủa và lắng cùng với DNA qua quá trình ly tâm.
Bảng 3.8: So sánh DNA thu được khi tủa bằng muối NaOAc và NaCl Muối Muối NaOAc NaCl Độ sáng băng DNA Lần 1 38,2 24,3 Lần 2 38,8 28,4 Lần 3 35,2 23,9 Trung bình 37,4 ± 1,93 25,5 ± 2,5 OD260/OD280 Lần 1 1,78 1,77 Lần 2 1,74 1,82 Lần 3 1,8 1,77 Trung bình 1,77 ± 0,03 1,79 ± 0,03
Tổng hợp các điều kiện khảo sát, quy trình tách chiết DNA được tiến hành như sau: Mỗi mẫu chứa 40 sợi lơng chó với độ dài khoảng 1 cm tính từ gốc được lắc trong 30 giây với 200 μl dung dịch ly giải (Tris-HCl 10 mM, pH 8; Triton X100 1%; SDS 1%; EDTA 10 mM) rồi ủ ở 50oC trong 20 phút để phá màng tế bào. Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), lắc 30 giây rồi ủ ở 50o
C trong 60 phút để tăng cường hiệu quả phá vỡ cấu trúc keratin và các protein khác. Tiếp tục bổ sung 100 μl dung dịch ly giải và ủ tiếp ở 50oC trong 20 phút nhằm giải phóng DNA triệt để. Pha nước chứa DNA sẽ được phân tách bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). DNA trong dịch nổi được tủa bằng NaCl 3M (nồng độ NaCl ở dung dịch cuối là 0,2M) và ethanol tuyệt đối lạnh, ủ mẫu ở -30ºC trong 30 phút để đạt hiệu quả tối đa. Ly tâm thu tủa và rửa bằng ethanol 70º lạnh. Sau khi làm khô, DNA được hồ với 30 μl nước cất vơ trùng và bảo quản ở -30ºC (Hình 3.5).
Hình 3.5: Quy trình tách chiết DNA từ lơng chó
3.2.1.2. So sánh hiệu quả của quy trình tách chiết DNA từ lơng chó
Hiệu quả tách chiết DNA của quy trình được so sánh với một số quy trình tách chiết DNA đã được cơng bố trên thế giới cũng như với bộ kit GeneAll (Thermo Fisher Scientific). Các quy trình được sử dụng so sánh bao gồm: quy trình xây dựng trong đề tài (quy trình 1); quy trình tách chiết DNA từ tóc do Hue và cộng sự đề xuất [32] (quy trình 2); quy trình tách chiết DNA từ tóc, sử dụng bột giặt và dung
dịch đệm PCR [25] (quy trình 3) và quy trình tách chiết DNA từ bộ kit GeneAll (quy trình 4).
Sản phẩm của các quy trình tách chiết được điện di trên gel agarose 1%. Quy trình 1 cho băng DNA sáng rõ (Hình 3.6), DNA thu được có nồng độ 6,6 ng/µl với độ tinh sạch cao (OD260/OD280 = 1,94); tương đương với độ tinh sạch của DNA thu được từ bộ kit (OD260/OD280 = 1,94). Các bộ kit bán trên thị trường thường sử dụng những cột có ái lực với chỉ DNA, với ưu điểm đơn giản, ít tốn thời gian và cho sản phẩm DNA có độ tinh sạch cao, tuy nhiên, các sản phẩm thương mại này lại có giá thành cao, vượt khả năng tài chính của các phịng thí nghiệm nhỏ. Bên cạnh đó, nhà sản xuất chỉ cung cấp các dung dịch pha sẵn và quy trình tách chiết mà khơng nêu rõ thành phần hóa chất; do đó, khơng thể kiểm sốt cũng như khơng thể áp dụng các biện pháp loại bỏ hóa chất một cách an tồn và vệ sinh.
Hình 3.6: So sánh hiệu quả một số quy trình tách chiết DNA
1. Thang DNA 1 kb plus; 2. Quy trình 1; 3. Quy trình 2; 4: Quy trình 3; 5: Quy trình 4; 6: Đối chứng âm.
Quy trình 2 được đề xuất bởi Hue và cộng sự [32] cho vạch DNA là sáng nhất, với nồng độ DNA thu được từ quy trình này lên đến 18,95 ng/µl. Đây là quy trình thu được lượng DNA cao nhất trong các quy trình tách chiết khảo sát. Tuy nhiên, độ tinh sạch của quy trình đề xuất bởi các tác giả này (OD260/OD280 = 1,69), thấp hơn so với quy trình 1 và quy trình 4 (1,97). Hơn nữa, quy trình này tốn khá nhiều thời gian cho việc thay đổi nhiệt độ ủ mẫu ở hai mức nhiệt độ 85ºC và 65ºC
và sử dụng hai loại dung dịch đệm chiết khác nhau. Quy trình chúng tơi đề xuất (quy trình 1) có thể lượng sản phẩm DNA thu được không nhiều hơn so với quy trình của Hue và cộng sự, nhưng vẫn đảm bảo chất lượng về độ nguyên vẹn và độ tinh sạch của DNA. Một ưu điểm nữa là quy trình chỉ cần một loại dung dịch đệm chiết và một nhiệt độ ủ ổn định là 50ºC.
Xét về sự đơn giản, quy trình tách chiết DNA được đề xuất bởi Guan và cộng sự [25] tỏ ra ưu thế hơn cả. Tế bào lông bị phân hủy bởi các hóa chất có trong bột giặt để giải phóng DNA vào dung dịch. Thực tế trong thử nghiệm, do khơng có chính xác các bột giặt như đã dùng trong nghiên cứu của Guan, chúng tôi đã sử dụng bột giặt OMO có sẵn ở Việt Nam. Kết quả đo OD và điện di cho thấy, dịch DNA thu thập được có giá trị OD cao (2,67), nhưng ngồi DNA thu được, mẫu còn chứa nhiều protein, RNA và các thành phần khác của tế bào do khơng có bước tinh sạch DNA. Phản ứng PCR sử dụng DNA thu thập được từ phương pháp tách chiết này có tỷ lệ thành cơng thấp (6/30 mẫu). Quy trình này có lợi thế về tiết kiệm thời gian và mức độ đơn giản, nhưng DNA thu được khó sử dụng cho các nghiên cứu sâu hơn vì cịn lẫn nhiều tạp chất.
Một trong những khó khăn chính trong nghiên cứu chó lưng xốy Phú Quốc hiện nay là cơng tác thu thập nguồn nguyên liệu cung cấp DNA. Mặc dù mẫu máu được sử dụng khá phổ biến cho các mẫu nghiên cứu động vật [43], nhưng việc thu thập máu chó lưng xốy Phú Quốc với số lượng lớn gặp khó khăn bởi việc xâm phạm đến cơ thể con vật cũng như không nhận được sự đồng ý của chủ vật ni. Vì vậy, mẫu lơng chó đã được lựa chọn làm nguồn nguyên liệu tách chiết DNA bởi quá trình thu thập lơng chó ít xâm phạm cũng như khơng gây đau đớn cho con vật. Quy trình tách chiết DNA từ lơng chó do chúng tôi đề xuất có thao tác đơn giản, thời gian không quá dài, lợi thế về mặt giá thành, phù hợp với điều kiện ở hầu hết các phịng thí nghiệm nhưng chất lượng sản phẩm DNA thu nhận vẫn đảm bảo, có thể phục vụ tốt cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Tách chiết DNA từ lơng chó
DNA từ các mẫu lơng chó thu thập được (gồm 100 mẫu chó lưng xốy Phú Quốc và 100 mẫu chó nhà Việt Nam) được tách chiết theo quy trình đã được xây dựng. Một số mẫu, chẳng hạn PQ33, PQ34 cho tín hiệu điện di sáng nhưng trải thành vệt dài, cho thấy DNA hệ gen ít nhiều đã bị đứt gãy (Hình 3.7). Mẫu PQ38, PQ39 với tín hiệu điện di yếu cho thấy nồng độ DNA thu được không cao. Hầu hết các các mẫu cịn lại đều cho tín hiệu sáng, rõ trên bảng điện di. DNA thu được sẽ làm nguyên liệu cho phản ứng PCR khuếch đại vùng HV1 tiếp theo.
Hình 3.7: DNA tổng số tách chiết được của các mẫu từ PQ33 đến PQ42
3.2.3. Khuếch đại vùng HV1
DNA sau khi được tách chiết sẽ được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng khuếch đại vùng trình tự HV1 DNA ty thể, để tiếp đó, nguồn nguyên liệu – sản phẩm PCR – này sẽ được sử dụng trong việc giải trình tự nucleotide. Nhằm nâng cao hiệu quả và tính chính xác trong việc giải trình tự tiếp theo, các mồi cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự và giải trình tự được lựa chọn theo phương pháp semi- nested PCR, trong đó, cặp mồi 15412F - 16625R được sử dụng trong phản ứng khuếch đại số lượng DNA mục tiêu và cặp mồi 15412F – 16114R sẽ được dùng trong kỹ thuật giải trình tự nucleotide. Theo lý thuyết, sản phẩm DNA được khuếch đại có kích thước là khoảng 1200 cặp base.
Sản phẩm của các phản ứng khuếch đại DNA được kiểm tra thông qua điện di trên gel agarose 1%. Tín hiệu của các băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí ở giữa băng 1000 cặp base và 1500 cặp base của thang DNA 1Kb (Hình 3.8), phù hợp với kích thước mong đợi theo lý thuyết vào khoảng 1200 cặp base. Bước đầu có thể nhận định là các phản ứng PCR đã thành cơng, khuếch đại được trình tự DNA mong muốn. Tuy nhiên, các sản phẩm này cần được xác định trình tự nucleotide để có thể khẳng định tính chính xác của phản ứng PCR. Các sản phẩm PCR sau đó sẽ được gửi đi giải trình tự nucleotide.
3.2.4. Đọc và biên tập trình tự nucleotide
Cặp mồi 15412F-16114R hoạt động không hiệu quả trong phản ứng PCR khi sử dụng DNA tổng số làm nguyên liệu nhưng hoạt động tốt khi thử nghiệm sử dụng sản phẩm PCR làm nguyên liệu. Sản phẩm PCR cho tín hiệu rõ đẹp trên gel agarose 1% qua quá trình điện di. Vì vậy, cặp mồi này được sử dụng cho phản ứng giải trình tự.
Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm FinchTV. Những mẫu có kết quả giải trình tự cho tín hiệu khơng rõ ràng sẽ được giải trình tự lại, nếu kết quả giải trình tự lần hai vẫn cho tín hiệu khơng tốt sẽ bị loại khỏi các mẫu khảo sát. Ở mỗi mẫu, hai trình tự nucleotide được đọc bằng mồi 15412F và 16114R sẽ được so sánh với nhau để kiểm chứng. Trình tự cuối cùng được khẳng định bởi cả hai mồi sẽ là trình tự nucleotide của mẫu tương ứng. Hai trăm mẫu DNA khảo sát trong đề tài là những mẫu có kết quả giải trình tự rõ ràng, đặc biệt là ở vùng trình tự 582 cặp base cần phân tích. Mỗi trình tự này khi được so sánh với các trình tự trong cơ sở dữ liệu GenBank [13] bằng chương trình BLAST [8] đều cho kết quả tương đồng rất cao với các trình tự DNA ty thể của chó nhà. Kết quả này cho phép khẳng định rằng các trình tự DNA ty thể của các mẫu chó được sử dụng trong nghiên cứu này đã được khuếch đại thành công.
Lấy mẫu VD22 làm ví dụ, đây là mẫu mà các phân tích sau này xác định là một haplotype thuộc haplogroup C mang một đột biến mới (A biến đổi thành G tại vị trí 15613). Hình 3.9 là một phần kết quả giải trình tự của mẫu VD22 này, với nửa trên là trình tự với được đọc với mồi 15412F và nửa dưới là trình tự đảo ngược bổ sung (reverse complement) của trình tự được đọc với mồi 16614R. Đoạn trình tự được thể hiện trong hình là đoạn khoảng chừng 40 nucleotide bao gồm vị trí 15613 (được đánh dấu mũi tên). Cả hai kết quả giải trình tự đều cho kết quả rõ, đẹp, khơng có tín hiệu nhiễu và đều khẳng định vị trí 15613 là một guanine. Các phân tích sau này cho thấy đột biến A15613G này là một vị trí đột biến mới, chưa từng được phát hiện trên thế giới.
Hình 3.9: Một đoạn kết quả giải trình tự mẫu VD22
Hai trăm trình tự sau khi được giải mã, biên tập, và tách thông tin vùng 582 cặp base đã được nộp lên ngân hàng gen GenBank. Sau khi được kiểm tra và chứng thực, các trình tự của chó nhà Việt Nam được cấp mã số truy cập (accession number) từ MG799222 đến MG799321 (Phụ lục 7), và các trình tự của chó lưng xoáy Phú Quốc được cấp mã số truy cập từ MG793253 đến MG793352 (Phụ lục 8).
3.2.5. Xác định haplotype của các mẫu chó lưng xốy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam Nam
Các mẫu DNA chó sử dụng trong nghiên cứu bao gồm 100 mẫu chó lưng xốy Phú Quốc và 100 mẫu chó nhà Việt Nam sau khi được giải trình tự sẽ được biên tập thủ công với sự trợ giúp của phần mềm FinchTV 1.4.0 và SeaView 4.2.12 để loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu và các đỉnh màu khơng rõ ràng. Trình tự tổng gộp (consensus sequence) sau biên tập đã được so sánh với trình tự tham khảo để xác định vùng 582 cặp base. Tồn bộ 200 trình tự này lần lượt được đưa vào công cụ định loại haplotype để xác định nhanh haplotype, làm cơ sở đánh giá sự đa dạng di
truyền của quần thể chó lưng xốy Phú Quốc (Bảng 3.9 và Bảng 3.10). Đa số các mẫu có haplotype thuộc 3 haplogroup thường gặp là A, B, C. Hầu hết các mẫu (197/200) có haplotype đã được cơng bố trên thế giới. Ngoài ra, 3 mẫu VD19, PQ64, VD22 có haplotype mới chưa từng được công bố trên thế giới, được đặt tên lần lượt là An1 (thuộc haplogroup A), Cn1, Cn2 (thuộc haplogroup C). Đặc biệt, ở các mẫu chó lưng xốy Phú Quốc cịn xuất hiện với tỷ lệ lớn các haplotype thuộc haplogroup E là nhóm các haplotype hiếm, vốn có tỷ lệ thấp trên thế giới. Đây sẽ là nguồn thông tin quý giá giúp làm sáng tỏ nguồn gốc chó lưng xốy Phú Quốc q của Việt Nam.