CHƢƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.2. Thu thập và xử lý mẫu
Đề tài sử dụng hai nhóm chó để khảo sát: chó lưng xốy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam. Cụm từ “Chó nhà Việt Nam” sử dụng trong đề tài để chỉ nhóm chó nhà (chó cỏ) Việt nam khơng có các đặc điểm hình thái giống các giống chó ngoại nhập thơng thường như chó đốm, chó Shepherd của Đức,… và khơng bao gồm chó lưng xốy Phú Quốc. Các tiêu chí để nhận diện chó lưng xốy Phú Quốc sử dụng trong đề tài bao gồm:
(1) Có xốy lưng. Đây là đặc điểm khơng độc quyền của chó lưng xốy Phú Quốc (chó lưng xốy Thái Lan cũng có đặc điểm này) cũng như khơng phải tất cả các chó lưng xốy Phú Quốc đều có lưng xốy. Việc sử dụng đặc điểm có xốy lưng nhằm giảm thiểu việc thu mẫu nhầm với các giống chó khơng có lưng xốy khác.
(2) Có nguồn gốc từ đảo Phú Quốc (chó hoặc chó cha mẹ đang sống trên đảo hoặc được mang đi nơi khác từ đảo)
(3) Chó trưởng thành (hơn 1 tuổi), trơng khỏe mạnh, có thể trọng khoảng 15 kg, chiều cao khoảng từ 45 – 55 cm. Chiều cao, cân nặng của chó khơng phải là đặc điểm tiên quyết để phân biệt với chó lưng xốy Thái Lan. Tuy nhiên, việc kết hợp đặc điểm này với các đặc điểm (1), (2) cũng giúp giảm thiểu việc thu mẫu nhầm với chó lưng xốy Thái Lan.
(4) Đầu chó nhỏ, sọ dài, tai nhỏ và đứng. Đi chó cong vút cần câu tạo thành ẵ n ắ vũng trũn, õy l c im dễ thấy ở chó lưng xốy Phú Quốc, đã được ghi nhận bởi Nguyễn Hữu Chiếm và cộng sự, Đại học Cần Thơ.
(5) Các đặc điểm về đốm lưỡi, màng bơi, móng đeo nếu có thì sẽ góp phần khẳng định chó lưng xốy Phú Quốc, nhưng khơng được xem là đặc điểm phải có.
Để dễ dàng trong việc đề cập và so sánh với các giống chó khác, đề tài xem hai nhóm chó khảo sát là hai giống chó riêng biệt, dù hai giống chó này chưa được FCI công nhận là “giống” về mặt phân loại học.
Các nghiên cứu tương tự trên thế giới đối với các giống chó khác nhau thường được thực hiện với số lượng mẫu là 30 con chó hoặc nhiều hơn để có ý nghĩa thống
kê. Căn cứ trên tình hình nghiên cứu chung trên thế giới và nguồn lực của đề tài, 200 mẫu lơng chó bao gồm 100 con chó lưng xốy Phú Quốc và 100 con chó nhà Việt Nam trong nghiên cứu này được thu thập từ đảo Phú Quốc, thành phố Rạch Giá (Kiên Giang), Thành phố Hồ Chí Minh và các vùng phụ cận (Lâm Đồng, Bình Dương) (Hình 2.5; chi tiết ở Phụ lục 4, Phụ lục 5). Những mẫu chó nhà Việt Nam được chọn ở vùng ngoại ô hoặc trong rẫy cách xa khu vực trung tâm để giảm thiểu khả năng lai tạp từ các giống chó ngoại quốc. Những mẫu chó có mối quan hệ gần gũi theo dòng mẹ sẽ bị loại trừ.
Hình 2.5: Vị trí thu mẫu và số lượng mẫu thu được
Các vùng thu mẫu được tô màu đỏ. Tên của tỉnh/thành phố được thể hiện gần vùng tơ đỏ, các con số phía dưới tên tỉnh/thành phố thể hiện lần lượt số lượng mẫu chó
Để an toàn cho người thu mẫu, và dựa trên sự đồng ý của chủ ni chó, lơng đi chó được lựa chọn để thu thập mẫu. Sử dụng kẹp đã rửa sạch bằng cồn 96º để nhổ lấy cả phần gốc của sợi lông. Số lượng sợi lơng thu cho mỗi mẫu ít nhất là 80 sợi, đủ cho hai lần tách chiết DNA. Ở thực địa, lơng chó được trữ trong các túi ny- lơng riêng biệt có khóa kéo và đưa về phịng thí nghiệm. Sau đó, lơng chó được cắt ngắn khoảng 1 cm tính từ gốc, rửa bằng nước cất vô trùng, cho vào eppendorf 1,5 ml và giữ mẫu ở nhiệt độ -30ºC cho đến khi sử dụng.
2.2.2.3. Tách chiết DNA tổng số từ lơng chó
DNA được tách chiết bằng phương pháp sử dụng Phenol:Chloroform [39], [69], phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm sinh học phân tử thơng thường. Quy trình tách chiết được xây dựng bao gồm hai bước ủ với dung dịch ly giải nhằm nâng cao hiệu quả phá vỡ màng tế bào, màng nhân. Đầu tiên, màng tế bào sẽ được phá vỡ bằng các chất tẩy SDS, Triton X100 có trong dung dịch ly giải. Sau khoảng chừng 20 phút, proteinase K được thêm vào nhằm phân hủy các protein nội bào. Các điều kiện của quá trình tách chiết DNA cần được khảo sát bao gồm thời gian ủ mẫu, nhiệt độ ủ mẫu, và muối dùng trong tủa DNA.
Theo các nghiên cứu trước đây, nhiệt độ ủ mẫu với proteinase K thường là 50oC [80], 56oC [15], [58], hay 65oC [32] trong nhiều khoảng thời gian khác nhau. Theo khuyến cáo từ nhà sản xuất (Fermentas), proteinase K đang được sử dụng hoạt động tốt trong khoảng từ 50 đến 65oC và thời gian từ 40 đến 60 phút. Vì vậy, các mốc nhiệt độ 50oC, 56oC và 65oC được khảo sát nhằm xác định nhiệt độ ủ mẫu thích hợp nhất trong kỹ thuật tách chiết DNA. Ở nhiệt độ thích hợp nhất, hai khoảng thời gian ủ mẫu với proteinase K là 40 phút và 60 phút cũng được thử nghiệm và đánh giá. Sau khi được phân tách ra khỏi các thành phần không mong muốn bằng hỗn hợp phenol:chloroform, DNA sẽ được tủa bằng ethanol tuyệt đối lạnh với sự có mặt của muối natri acetate (NaOAc) 0,3M hoặc NaCl 0,2M. Trong các thí nghiệm khảo sát, số lượng sợi lông sử dụng là 40 sợi. Riêng trong trường hợp so sánh khả năng tủa DNA với hai loại muối khác nhau, 80 sợi lông được sử dụng để nâng cao
nồng độ DNA thu được. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, các điều kiện khảo sát được tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1: Nội dung và điều kiện khảo sát quy trình tách chiết DNA
Nội dung khảo sát Điều kiện khảo sát
Nhiệt độ ủ mẫu 50oC 56oC 65oC Thời gian ủ mẫu 40 phút 60 phút Muối dùng để tủa DNA NaOAc 0,3M NaCl 0,2M
DNA thu được trong các điều kiện khảo sát khác nhau sẽ được so sánh, đánh giá thông qua điện di trên gel agarose 1%, tỷ số OD260nm/OD280nm và khả năng sử dụng được trong các phản ứng PCR tiếp sau đó. Độ sáng của các băng DNA sẽ được xác định và so sánh bằng phần mềm ImageJ2 [66]. Chương trình này sẽ phân tích hình ảnh của bảng gel điện di và thể hiện độ đậm của vùng khảo sát bằng đồ thị, với độ sáng của các băng DNA tương ứng với độ cao của các đỉnh (peak) trên đồ thị. Vùng diện tích dưới mỗi đỉnh, sau khi trừ đi tín hiệu nền, được xem là giá trị đại diện độ sáng của băng DNA trên bảng gel. Để dễ dàng trong việc so sánh độ sáng băng DNA, các giá trị này được quy về thành phần phần trăm (%) tổng độ sáng của các băng DNA khảo sát.
Mỗi mẫu chứa 40 sợi lơng chó với độ dài khoảng 1 cm tính từ gốc được lắc (vortex) trong 30 giây rồi ủ trong dung dịch ly giải (Tris-HCl 10 mM, pH 8; Triton X100 1%; SDS 1%; EDTA 10 mM) ở nhiệt độ thích hợp trong 20 phút để phá màng tế bào. Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), lắc trong 30 giây rồi ủ ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp để tăng cường hiệu quả phá vỡ cấu trúc keratin và các protein khác. Tiếp tục bổ sung 100 μl dung dịch ly giải và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp nhằm giải phóng DNA triệt để. Pha nước chứa DNA sẽ được phân tách bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). DNA trong dịch nổi được tủa bằng muối và ethanol tuyệt đối lạnh, ủ mẫu ở -30ºC trong 30 phút để đạt hiệu quả tối đa. Ly tâm thu tủa và rửa bằng ethanol 70º lạnh. Sau khi làm khơ, DNA được hồ với 30 μl nước cất vơ trùng và bảo quản ở -30ºC (Hình 2.6).
Hình 2.6: Quy trình tách chiết DNA
Các công việc tách chiết DNA, điện di trong đề tài được tiến hành với các hóa chất thơng dụng trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử, chẳng hạn như phenol, chloroform, NaCl 3M, cồn tuyệt đối... (Phụ lục 1). Các hóa chất được pha ở nồng độ cao (dung dịch mẹ), được vô trùng bằng hơi nước ở 120oC, 1 atm (hầu hết các hóa chất) hoặc lọc bằng màng lọc 0,2 μm (dung dịch SDS). Các dung dịch mẹ
này được lưu trữ ở nhiệt độ thích hợp và được pha đến nồng độ sử dụng trong phịng thí nghiệm bằng nước cất hai lần vô trùng.
2.2.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng quang phổ kế
Các mẫu DNA sau khi được tách chiết DNA sẽ được xác định độ tinh sạch và nồng độ bằng máy đo mật độ quang Genova Plus. Các chỉ số OD của DNA được đo ở các bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm và 320 nm.
Độ tinh sạch của mẫu DNA thu được dựa trên tỷ số OD260nm/OD280nm và OD260nm/OD230nm. Dung dịch nucleic acid được xem là sạch, không tạp nhiễm khi tỷ số OD260nm/OD280nm trong khoảng 1,8 – 2,0 và tỷ số OD260nm/OD230nm trong khoảng 2,0 – 2,2. OD320nm được xem là tín hiệu nền của các mẫu khảo sát.
Tỷ số OD được tính theo cơng thức do nhà sản xuất Genova cung cấp:
OD260/280 =
OD260/230 =
Cách tính nồng độ DNA trong dung dịch khi đo quang: CDNA (ng/µl) = (OD260nm – OD320nm) x 50 Trong đó:
CDNA: nồng độ của DNA trong dung dịch (ng/µl). OD230: Giá trị OD đo được ở bước sóng 230 nm. OD260: Giá trị OD đo được ở bước sóng 260 nm. OD280: Giá trị OD đo được ở bước sóng 280 nm. OD320: Giá trị OD đo được ở bước sóng 320 nm.
DNA tinh sạch được bảo quản trong nước ở -30 ºC đến khi sử dụng.
2.2.2.5. Khuếch đại trình tự vùng HV1 bằng phản ứng PCR
Các phản ứng PCR trong đề tài được tiến hành với Prime Taq Premix G2000 (GeNet Bio – Hàn Quốc), trong đó, các thành phần chung như DNA polymerase, dung dịch đệm, MgCl2, các nucleotide đã được pha sẵn. Các mồi dùng trong phản
ứng PCR và giải trình tự nucleotide được tổng hợp bởi cơng ty IDT (Mỹ).
Vùng HV1 DNA ty thể của các mẫu khảo sát được khuếch đại với các mồi 15412F và 16625R (Bảng 2.2 và Hình 2.7) theo nghiên cứu của Gundry và cộng sự [26]. Các mẫu DNA tách chiết được khuếch đại số lượng với thành phần phản ứng PCR bao gồm master mix với tên thương phẩm Prime Taq Premix (2X) của hãng
GenetBio – Hàn Quốc (0,1U/µl Taq DNA Polymerase; 0,4 mM dNTP; 4 mM
MgSO4; 20 mM KCl; 16 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl, pH8,8); 1 µl mồi xi (15412F, 10 µM); 1 µl mồi ngược (16625R, 10 µM); 2 µl DNA mẫu; nước cất vơ trùng vừa đủ 20 µl [26]. Chương trình PCR gồm các bước như sau:
- Giai đoạn biến tính (1 chu kỳ): 95ºC trong 5 phút - Giai đoạn chính (35 chu kỳ):
+ biến tính ở 95ºC trong 30 giây + mồi bắt cặp ở 49ºC trong 30 giây
+ tổng hợp mạch DNA mới ở 72ºC trong 1 phút
Bảng 2.2: Các mồi sử dụng cho phản ứng khuếch đại vùng HV1 DNA ty thể
Hình 2.7: Vị trí các mồi sử dụng trong phản ứng PCR và trong giải trình tự
Cặp mồi 15412F – 16625R được sử dụng để khuếch đại vùng trình tự HV1, cặp mồi 15412F – 16114R được sử dụng để giải trình tự 582 cặp base vùng HV1 (từ vị trí
nucleotide 15458 đến 16039) 2.2.2.6. Giải trình tự và biên tập trình tự
Sản phẩm PCR được giải trình tự tự động bằng phương pháp Sanger [71] tại
NICEM – Hàn Quốc (The National Instrumentation Center for Environmental Management). Mỗi sản phẩm khuếch đại vùng HV1 được gửi đi giải trình tự hai mạch độc lập với hai mồi 15412F và 16114R (Bảng 2.2 và Hình 2.7). Kết quả giải trình tự được hiển thị trên phần mềm FinchTV dưới dạng đồ thị huỳnh quang (Hình 2.8). Trình tự nucleotide sau khi đọc được biên tập bằng mắt với sự trợ giúp của phần mềm FinchTV 1.4.0 và SeaView 4.2.12 để loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu, các đỉnh màu khơng rõ ràng. Hai mạch của một trình tự được giải độc lập, sẽ được so sánh để khẳng định một nucleotide ở một vị trí nhất định, nâng cao độ tin cậy của
Tên mồi Trình tự nucleotide
Nhiệt độ nóng chảy Kích thƣớc sản phẩm Tài liệu tham khảo 15412F 5’-CCACTATCAGCACCCAAAG-3’ 53,2 oC 1,2 kb Gundry và cs. [26] 16625R 5’-AGACTACGAGACCAAATGCG-3’ 54,6 oC 16114R 5’- CCTGAAACCATTGACTGAATAG-3’ 51 oC
kết quả giải trình tự. Tất cả các trình tự đều được sắp gióng cột với trình tự tham khảo chuẩn (mã số GenBank U96639.2 [37]) để xác định đoạn trình tự 582 cặp base. Vùng trình tự này sẽ được sử dụng cho các phân tích về sau.
Hình 2.8: Một đoạn đồ thị huỳnh quang – kết quả giải trình tự mẫu PQ101
2.2.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lưng xốy Phú Quốc dựa trên đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể
Các số liệu trong đề tài được xử lý thống kê bằng phần mềm thống kê R [61]. Các biểu đồ thể hiện, minh họa số liệu tính tốn được cũng như các chỉ số về đa dạng di truyền quần thể được tính tốn bằng phần mềm chuyên dụng Arlequin 3.5 [20].
2.2.3.1. Xác định độ đa dạng haplotype
Độ đa dạng haplotype là xác suất bắt được ngẫu nhiên hai haplotype khác nhau trong quần thể. Trong đề tài, các thông số này được thực hiện bằng phần mềm Arlequin 3.5 [20], với các công thức:
a. Độ đa dạng haplotype:
̂
∑
b. Phương sai của chỉ số độ đa dạng: ̂ { [∑ (∑ ) ] ∑ (∑ ) } Độ lệch chuẩn: s.d.( ̂) = √ ̂ Trong đó: n là tổng số trình tự trong quần thể
k là số lượng các haplotype trong quần thể pi là tần số của haplotype i trong quần thể
2.2.3.2. Xác định độ đa dạng nucleotide
Độ đa dạng nucleotide là số nucleotide khác biệt trung bình mỗi vị trí giữa hai trình tự DNA bất kỳ trong quần thể. Nói cách khác, chỉ số độ đa dạng nucleotide thể hiện xác suất bắt được ngẫu nhiên hai nucleotide khác nhau tại một vị trí bất kỳ trên hai trình tự DNA bất kỳ trong quần thể. Trong đề tài, các thông số này được thực hiện bằng phần mềm Arlequin 3.5 [20], với các công thức:
a. Độ đa dạng nucleotide:
̂ ∑ ∑ ̂
b. Phương sai của độ đa dạng nucleotide:
̂ ̂ ̂ Độ lệch chuẩn: s.d.( ̂ = √ ̂ Trong đó: n là tổng số trình tự trong quần thể
dịj là số đột biến xảy ra giữa hai haplotype i và j k là số lượng các haplotype trong quần thể pi là tần số của haplotype i trong quần thể
2.2.3.3. Xây dựng mạng lưới quan hệ của các haplotype
Mối quan hệ giữa các haplotype có thể được thể hiện rõ hơn bằng cách biểu diễn dưới dạng một mạng lưới. Trong đó, mỗi haplotype là một nút mạng (node), hai haplotype kế cận được nối nhau bằng một đường nối thể hiện nucleotide sai khác giữa hai haplotype đó.
Mạng lưới ban đầu thể hiện mối quan hệ giữa các haplotype trong quần thể và số nucleotide sai khác của các haplotype kế cận được tính bởi phần mềm Arlequin 3.5 [20]. Trong trường hợp những haplotype sai khác nhiều hơn 1 nucleotide so với haplotype gần nhất, các haplotype trung gian sẽ được tìm kiếm thủ cơng trong danh sách các haplotype đã được công bố, và sẽ được chèn vào mạng lưới ở vị trí tương ứng. Trong đề tài, mạng lưới quan hệ giữa các haplotype bao gồm các haplotype có trong quần thể và các haplotype trung gian khơng có trong quần thể, sao cho mỗi haplotype chỉ sai khác 1 nucleotide so với haplotype gần nhất.
2.2.3.4. Xác định khoảng cách di truyền giữa hai quần thể
Khoảng cách di truyền (DA) giữa hai quần thể là số nucleotide khác biệt trung bình giữa hai quần thể [50], được phần mềm Arlequin 3.5 tính theo cơng thức:
̂ ∑ ∑ ̂ ̂ ̂ Trong đó
D: độ khác biệt nucleotide thơ trung bình giữa hai quần thể
DA: khoảng cách di truyền, là độ khác biệt nucleotide trung bình giữa hai quần thể sau khi trừ đi độ khác biệt trong nội bộ mỗi quần thể k và k’ là số haplotype tương ứng trong quần thể 1 và 2
là tần số của haplotype thứ i trong quần thể 1
2.2.3.5. Phân tích phương sai phân tử (AMOVA)
Khác biệt di truyền giữa các nhóm cá thể trong một lồi có thể được đánh giá