4. 2.1.1 Định tính trong ống nghiệm
4.2.2.5. Với thành phần saponin Định tính saponin bằng ống nghiệm:
Định tính saponin bằng ống nghiệm:
Tiến hành chiết xuất saponin trong một số vị thuốc và các ph−ơng thuốc NTTGG theo quy trình sau:
Nguyên liệu đ−ợc làm nhỏ, chiết nóng với dung môi là n−ớc, cô đặc dịch chiết, thêm cồn 96o để kết tủa protid. Để lạnh qua đêm, lọc lấy dịch, cô bay hơi hết cồn. Dùng ether dầu hoả để loại chlorophyl, chất béo. Gạn lấy dịch chiết n−ớc. Chiết saponin bằng n-butanol. Cất thu hồi n-butanol, cắn thu đ−ợc chứa saponin. Hoà tan cắn trong cồn 80o. Lọc lấy dịch lọc, tiến hành các phản ứng định tính và triển khai SKLM của saponin. Quy trình chiết xuất saponin đ−ợc tóm tắt trong sơ đồ ở hình 4.14.
D−ợc liệu Dịch chiết Cồn 96o Dịch n−ớc Saponin / n-butanol n- butanol
Thu hồi n-butanol
Cắn saponin toàn phần
Ether dầu hoả Dịch chiết n−ớc đã loại clorophyl, chất
Bốc hơi cồn, thêm n−ớc Dịch cồn
N−ớc cất, to (sôi)
Cô Cao 1: 2
Hình 4.14: Sơ đồ chiết xuất saponin toàn phần
Dịch chiết thu đ−ợc đem thực hiện các phản ứng định tính sau:
− Phản ứng tạo bọt;
− Phân biệt saponin steroid và saponin triterpenic.
− Phản ứng phá huyết;
− Phản ứng Rosenthaler;
− Phản ứng Lieberman - Burchard;
− Phản ứng Salkowski;
− Phản ứng với vanilin 1% / cồn/ H2SO4 đặc; Kết quả nghiên cứu đ−ợc thể hiện trong bảng 18.
Bảng 4.18: Kết quả định tính saponin trong các vị thuốc và ph−ơng thuốc
Mẫu thử Phản ứng Bán hạ Cam thảo Cóc mẳn NTTGGCANTTGGLHTrần bì Lá hen Cà độc d−ợc Tang bạch bì Tạo bọt +++ +++ +++ +++ +++ − − − − Phân biệt
saponin steroid triterpen triterpen triterpen triterpen
Phá huyết +++ ++ ++ ++ ++ − − − − Rosenthaler +++ +++ ++ +++ +++ − − − − Lieberman- Burchard +++ +++ ++ +++ +++ − − − − Salkowski ++ ++ ++ ++ +++ − − − − Vanilin 1%/cồn/H2SO4 đặc +++ +++ +++ +++ +++ − − − −
Căn cứ kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong bán hạ có saponin steroid, trong cam thảo và cóc mẳn có saponin triterpenic. Thành phần saponin trong các ph−ơng thuốc NTTGGCA và NTTGGLH là tổ hợp saponin steroid và triterpenic của các vị thuốc trong ph−ơng thuốc.
Định tính saponin bằng SKLM:
Dùng dịch chiết cồn saponin nh− đã mô tả ở trên để chấm SKLM, sử dụng bản mỏng silicagel tráng sẵn của hãng Merck. Triển khai SKLM với các hệ dung môi sau:
Hệ 1: n-butanol: acid acetic: n−ớc (4: 1: 1); Hệ 2: cloroform: metanol (8: 2);
Hệ 3: n-butanol: ethylacetat: n−ớc (4: 1: 5) (lấy pha trên);
Hệ 4: cyclohexan: ethylaceta (4: 6);
Hệ 5: n-butanol: ethanol: amoniac (10: 2: 5); Hệ 6: cloroform : methanol: n−ớc (65: 35: 10). Hiện màu bằng thuốc thử vanilin 1%/cồn/H2SO4 đặc.
Kết quả cho thấy hệ 4 có khả năng tách tốt nhất: tách đ−ợc 9 vết saponin của ph−ơng thuốc NTTGGCA và NTTGGLH t−ơng ứng với 3 vết của cam thảo, cóc mẳn, bán hạ. Các vết này có hệ số Rf và màu sắc trong hình 4.15 và bảng 4.19.
Hình 4.15: SKĐ Saponin trong NTTGGLH
Chú thích: 1: NTTGGCA; BH: Bán hạ; CT: Cam thảo; CM: Cóc mẳn
Bảng 4.19: Rf và màu sắc các vết Saponin
Bán hạ Cam thảo Cóc mẳn NTTGGCA NTTGGLH TT
Rf* Màu Rf* Màu Rf* Màu Rf* Màu Rf* Màu
1 52 xanh 52 xanh 52 xanh
2 82 xanh 82 xanh 82 xanh
3 90 vàng 90 vàng 90 vàng
4 34 tím 34 tím 34 tím
5 71 vàng 71 vàng 71 vàng
6 85 đỏ 85 đỏ 85 đỏ
7 26 tím 26 tím 26 tím
8 62 xanh 62 xanh 62 xanh
9 67 vàng nâu 67 vàng nâu 67 vàng nâu
Nh− vậy, saponin trong các ph−ơng thuốc NTTGG chính là tổ hợp saponin của các vị thuốc có trong ph−ơng.
Định l−ợng saponin:
Cân chính xác khoảng 20g d−ợc liệu, đem chiết xuất trong bộ Soshlet bằng cồn 80o đến khi dịch chiết cho phản ứng âm tính của saponin. Đem cất thu hồi cồn. Cắn hoà tan trong n−ớc, loại chất béo, clorophyl bằng ether dầu hoả. Lấy lớp n−ớc, cô thành cắn. Hoà tan cắn bằng n−ớc để có dung dịch 10%. Chiết saponin bằng n-butanol. Cất thu hồi dung môi. Cắn chứa saponin toàn phần đem hoà tan trong một l−ợng vừa đủ cồn 80o, thêm hỗn hợp aceton-ether (4:1) với tỷ lệ gấp 2-3 lần thể tích của dung dịch cồn, xuất hiện tủa. Lọc lấy tủa, sấy khô đến khối l−ợng không đổi ở 80oC, cân. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, hàm l−ợng saponin toàn phần trong d−ợc liệu là giá trị trung bình của 3 lần định l−ợng. Qúa trình chiết xuất saponin để định l−ợng đ−ợc mô tả trong sơ đồ ở hình 4.16.
Dịch chiết / cồn
Cắn
N−ớc
Ether dầu hoả
N−ớc cất Cô Cắn Cô Cồn 80o Saponin / cồn Aceton: ether (4:1), lọc Cắn saponin Saponin / n-butanol n-butanol Thu hồi n-butanol
Cắn 10% / n−ớc
Dịch chiết n−ớc đã loại clorophyl, chất béo
Tủa saponin toàn phần
Dịch chiết / n−ớc Thu hồi cồn
Cồn 80o(Soxhlet)
Cô D−ợc liệu
Hình 4.16: Sơ đồ chiết xuất saponin trong ph−ơng thuốc NTTGG
Hàm l−ợng saponin toàn phần trung bình của các ph−ơng thuốc NTTGG đ−ợc thể hiện trong bảng 20.
Bảng 4.20: Hàm l−ợng saponin toàn phần trong các ph−ơng thuốc NTTGG.
STT Mẫu thử Hàm l−ợng saponin (%)
1 NTTGGCA 7,6
2 NTTGGLH 5,0
Hàm l−ợng saponin toàn phần trong ph−ơng thuốc NTTGGLH thấp hơn trong ph−ơng NTTGGCA.