4. 2.1.1 Định tính trong ống nghiệm
4.2.2.2. Với thành phần alcaloid
Định tính alcaloid:
Chiết xuất alcaloid từ các vị thuốc lá cà độc d−ợc, bán hạ, lá hen, bột NTTGGCA, bột NTTGGLH, và n−ớc sắc NTTGGCA, NTTGGLH theo các ph−ơng pháp chiết xuất alcaloid thông dụng. Các dịch chiết đ−ợc chia làm 2 phần, phần 1 đem thử các phản ứng định tính trong ống nghiệm, phần 2 đem tinh chế để SKLM.
Kết quả định tính alcaloid trong các mẫu thử đ−ợc trình bày trong bảng 7.
Bảng 4.7: Kết quả định tính alcaloid trong ống nghiệm
Mẫu thử TT Mayer TT Bouchardat TT Dragendorff Cà độc d−ợc +++ +++ +++ Bán hạ + + + Lá hen ++ ++ ++ NTTGGCA (bột) +++ +++ +++ NTTGGLH (bột) +++ +++ +++ NTTGGCA (n−ớc sắc) +++ +++ +++ NTTGGLH (n−ớc sắc) +++ +++ +++
Màu tủa Tủa trắng Tủa nâu đỏ Tủa vàng cam Nh− vậy, trong các mẫu thử đều có alcaloid.
SKLM:
Cắn alcaloid thu đ−ợc từ các mẫu thử sau khi tinh chế đ−ợc hoà tan trong 1ml cloroform rồi chấm lên bản mỏng silicagel tráng sẵn của hãng Merck đã hoạt hoá ở 110oC trong 1 giờ.
Mẫu thử gồm alcaloid của cà độc d−ợc, bán hạ, bột và n−ớc sắc NTTGGCA. Triển khai SKLM bằng các hệ dung môi:
Hệ I: cloroform : aceton: metanol: amoniac (35:77:5:15) Hệ II: cloroform: metanol (9:1)
Hệ III: n-butanol: acid acetic: n−ớc (40:8:20)
Hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff. Hệ III cho kết quả tốt nhất thể hiện ở hinh 4.9 và bảng 4.8. 5 4 5 4 4 1 3 3 3 2 1 1 2 1 a b c d
Hình 4.9: Sắc ký đồ alcaloid trong lá cà độc d−ợc (a), bán hạ (b),
bột NTTGGCA (c) và n−ớc sắc NTTGGCA (d).
Bảng 4.8: Giá trị Rf và màu sắc các vết alcaloid
Lá cà độc d−ợc Bán hạ Bột NTTGGCA N−ớc sắc NTTGGCA Vết Rf* Màu Vết Rf* Màu Vết Rf* Màu Vết Rf* Màu
a1 47,9 đỏ cam c1 47,9 đỏ cam d1 47,9 đỏ cam a2 53,4 đỏ cam c2 53,4 đỏ cam d2 53,4 đỏ cam a3 78,1 vàng xanh c3 78,1 vàng xanh d3 78,1 vàng xanh b1 89 vàng c4 89 vàng d4 89 vàng a4 97,3 đỏ cam c5 97,3 đỏ cam d5 97,3 đỏ cam
Nh− vậy, trên SKLM alcaloid của cà độc d−ợc cho 4 vết tách khá xa nhau, vết a1 có diện tích lớn nhất. Bán hạ cho 1 vết.
Trên SKLM, alcaloid chiết đ−ợc từ bột NTTGGCA và n−ớc sắc NTTGGCA đều cho 5 vết có màu sắc và hệ số Rf t−ơng tự các vết alcaloid của lá cà độc d−ợc và bán hạ, tuy diện tích vết nhỏ hơn và màu nhạt hơn. Điều này chứng tỏ alcaloid có trong ph−ơng thuốc NTTGGCA là tổ hợp alcaloid của 2 vị thuốc lá cà độc d−ợc và bán hạ.
Đối với mẫu thử 2 gồm alcaloid của lá hen, bán hạ, bột NTTGGLH và n−ớc sắc NTTGGLH, tiến hành triển khai SKLM bằng các hệ dung môi:
Hệ I: cloroform : metanol: amoniac (50 : 9: 1) Hệ II: aceton: metanol: amoniac (45: 9: 1) Hệ III: aceton: amoniac: n−ớc (45: 1: 5)
Hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff, kết quả cho thấy hệ dung mơi II có khả năng tách tốt hơn.
Kết quả triển khai SKLM alcaloid của lá hen, bán hạ, bột và n−ớc sắc NTTGGLH đ−ợc thể hiện trong hình 4.10 và bảng 4.9. 4 4 3 1 3 3 2 2 2 1 1 1
Hình 4.10: Sắc ký đồ alcaloid trong lá hen (a), bán hạ (b), bột NTTGGLH (c) và n−ớc sắc NTTGGLH (d)
a b c d
Bảng 4.9: Giá trị Rf và màu sắc các vết alcaloid
Lá hen Bán hạ Bột NTTGGLH N−ớc sắc NTTGGLH Vết Rf* Màu Vết Rf* Màu Vết Rf* Màu Vết Rf* Màu
a1 40 nâu c1 40 nâu d1 40 nâu a2 66 vàng c2 66 vàng d2 66 vàng a3 93 đỏ cam c3 93 đỏ cam d3 93 đỏ cam b1 96 vàng cam c4 96 vàng cam d4 96 vàng cam
Nh− vậy, trên SKLM, alcaloid chiết đ−ợc từ bột NTTGGLH và n−ớc sắc NTTGGLH đều cho 4 vết có màu sắc và hệ số Rf t−ơng tự các vết alcaloid
của lá hen và bán hạ. Điều này chứng tỏ alcaloid có trong ph−ơng thuốc NTTGGLH là tổ hợp alcaloid của 2 vị lá hen và bán hạ.
Định l−ợng alcaloid toàn phần:
− Chiết xuất alcaloid toàn phần từ bột d−ợc liệu trong ph−ơng thuốc
NTTGGCA và NTTGGLH:
Cân chính xác khoảng 10g bột d−ợc liệu, cho vào túi vải sạch rồi cho vào trong bình soxhlet, loại chất béo bằng ether dầu hoả trong 6 giờ. Để bay hơi hết ether dầu hoả rồi thấm ẩm bằng dd amoniac 10%. Chiết bằng bình soxhlet với dung mơi cloroform tới khi kiệt alcaloid trong d−ợc liệu. Thu dịch cloroform, tráng bình cầu nhiều lần bằng cloroform, gộp dịch cloroform vào bình gạn. Lắc với dd acid sunfuric 0,25M lần với 20, 10, 10, 10, 10ml, đến khi chuyển hết alcaloid sang dạng muối. Gộp dịch chiết acid vào bình gạn, kiềm hố bằng amoniac 10% đến pH 9,5, chiết alcaloid bằng cloroform 5 lần với 20, 10, 10, 10, 10ml, đến hết alcaloid. Gộp dịch chiết cloroform, làm khan bằng Na2SO4 khan, lọc. Bốc hơi cloroform, thu lấy cắn. Sấy cắn ở nhiệt độ 80oC đến khối l−ợng khơng đổi, cân.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Hàm l−ợng alcaloid tồn phần trung bình của 3 lần định l−ợng trong ph−ơng thuốc NTTGGCA và NTTGGLH đ−ợc thể hiện trong bảng10.
Bảng 4.10: Hàm l−ợng alcaloid toàn phần trong 2 ph−ơng thuốc NTTGG STT Bột của ph−ơng thuốc Hàm l−ợng alcaloid (%)
1 NTTGGCA 0,09
2 NTTGGLH 0,05
Nh− vậy hàm l−ợng alcaloid trong ph−ơng thuốc NTTGGCA cao hơn trong ph−ơng thuốc NTTGGLH.
Định l−ợng alcaloid toàn phần trong n−ớc sắc NTTGGCA và NTTGGLH
− Chuẩn bị dịch n−ớc sắc: các vị thuốc trong ph−ơng thuốc đ−ợc cân
theo công thức. Đổ n−ớc cất ngập d−ợc liệu, sắc nhỏ lửa trong 3 giờ (mỗi giờ lấy n−ớc sắc một lần, rồi lại đổ n−ớc cất ngập bã d−ợc liệu, tiếp tục sắc). Gộp dịch sắc, lọc nóng qua giấy lọc. Cơ đặc còn 50ml. Đem chiết alcaloid.
− Chiết xuất alcaloid từ n−ớc sắc: n−ớc sắc đ−ợc kiềm hoá bằng
amoniac 10% rồi chiết bằng cloroform (5 lần, mỗi lần 15 ml). Thu dịch chiết cloroform, chiết bằng dung dịch H2SO4 0,25M 5 lần với 20, 15, 10, 10, 10ml. Gộp dịch chiết acid, đem kiềm hoá bằng amoniac đến pH 9,5, chiết bằng cloroform 5 lần với 20, 15, 10, 10, 10ml. Gộp dịch chiết cloroform, làm khan bằng Na2SO4 khan, lọc. Bốc hơi cloroform thu đ−ợc cắn alcaloid. Cắn đem sấy khô tới khối l−ợng không đổi ở 80oC. Cân.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Hàm l−ợng alcaloid tồn phần trung bình của 3 lần định l−ợng trong n−ớc sắc ph−ơng thuốc NTTGGCA và NTTGGLH đ−ợc thể hiện trong bảng 11.
Bảng 4.11: Hàm l−ợng alcaloid toàn phần trong n−ớc sắc 2 ph−ơng thuốc
NTTGG STT N−ớc sắc của ph−ơng thuốc Hàm l−ợng alcaloid (%) 1 NTTGGCA 0,04 2 NTTGGLH 0,03
Nh− vậy, hàm l−ợng alcaloid trong n−ớc sắc thang NTTGGCA (0,04%) và NTTGGLH (0,03%) đều nhỏ hơn so với hàm l−ợng trong bột ph−ơng thuốc NTTGGCA (0,09%) và NTTGGLH (0,05%).