CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Gắn đoạn gen vào vector nhân dòng
Nguyên lý:
pJET1.2 là vector chọn lọc có kích thước 2974 bp, có khả năng tiếp nhận các đoạn chèn có kích thước từ 6 bp đến 10 kb. Đầu 5’ của vị trí tách dịng chứa các nhóm phosphoryl, do đó, khơng cần phosphoryl hóa các mồi PCR. Vector pJET1.2 nếu không được chèn đoạn DNA ngoại lai sẽ biểu hiện enzyme giới hạn Eco47IR gây chết và khơng hình thành khuẩn lạc trên mơi
trường ni cấy sau q trình biến nạp. Do đó, chỉ có những dịng tái tổ hợp chứa đoạn chèn mới phát triển được trên môi trường nuôi cấy.
Sản phẩm PCR thu được có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 bằng kit CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher)[40]. Thành phần phản ứng như Bảng 2.4:
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 6
2X reaction buffer 10 DNA Blunting Enzyme 1
Sản phẩm PCR 1
pJET1.2/blunt cloning
vector (50ng/µl) 1
T4 DNA Ligase 1
Tổng 20
Thực hiện phản ứng cắt tạo đầu bằng trên đá với thành phần phản ứng gồm 10 µl 2X Reaction Buffer, 1 µl sản phẩm PCR sau tinh sạch, thêm nước khử ion đến thể tích 17 µl sau đó bổ sung 1 µl DNA Blunting Enzyme. Hỗn hợp phản ứng được làm tan trong thời gian ngắn và li tâm trong 3 đến 5 giây và tiếp tục ủ ở 70°C trong 5 phút rồi cắm vào đá. Thêm 1 µl vector nhân dịng pJET1.2/blunt (50 ng/ml) và 1 µl T4 DNA Ligase vào ống phản ứng, làm tan nhẹ rồi li tâm 3 đến 5 giây. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 5 phút và giữ ở -20oC cho đến khi biến nạp.