Hệ biểu hiện Dạng vector
Vi khuẩn Escherichia coli Plasmid (episomal) Vi khuẩn Enterobacteria khác Pseudomonas spp. Vi khuẩn Firmicutes Bacillus spp. Sinh vật nhân thực Nấm đơn bào (nấm men) Nhóm Methylotrophic (Pichia pastoris, Hansenula
polymorpha) Plasmid (integrative) Nhóm Non-methylotrophic (Saccharomyces serevisiae, Kluyveromyces lactis) Plasmid (episomal/ integrative) Nấm sợi Aspergillus spp. Hypocrea/ Trichoderma spp. Plasmid (episomal/ integrative) Động vật
nguyên sinh Leishmania terantolae
Plasmid (integrative) Tế bào côn trùng Sf9, Sf21, High Five™ BTI-TN-5B1-4, S2 Plasmid (episomal); virus Tế bào động vật có vú CHO, HEK293 Plasmid (episomal/ integrative); virus
1.3.1.1. Hệ biểu hiện Escherichia coli.
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn gram âm, hình que, dài khoảnh 2
mm, đường kính 0,25-1 µM. Chúng là sinh vật hiếu khí, kị khí tùy tiện, thường được bắt gặp trong đường ruột, phát triển tốt trong các điều kiện nuôi cấy thông thường, nhiệt độ tối ưu là 37°C. E. coli chỉ có 1nhiễm sắc thể nằm trong thể nhân, là một chuỗi DNA trần với khoảng 4x106 cặp base.
E. coli có quá trình biểu hiện gen đơn giản gồm quá trình phiên mã,
dịch mã xảy ra đồng thời. mARN tổng hợp được sẽ sử dụng ngay để dịch mã mà khơng q trình sửa đổi sau phiên mã do khơng có các intron. Do sự đơn giản và tiện lợi đó mà E. coli là loại tế bào biểu hiện gen rộng rãi nhất hiện nay thông qua việc sử dụng các plasmid đặc thù cho các loại sản phẩm (protein ngoại lai) cần quan tâm. Đặc điểm các loại protein được biểu hiện ở
E. coli là: kích thước nằm trong khoảng 500 amino acidđến 80 amino acid,
không quá kị nước; Không chứa quá nhiều gốc disulfur do môi trường bên trong tế bào có tính khử cao…
E. coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực biểu hiện gen do có nhiều
ưu điểm: Dễ ni, mơi trường nuôi cấy, thiết bị, dụng cụ đơn giản, rẻ tiền - góp phần hạ giá thành sản phẩm. Loại E. coli thường dùng đã được xử lý nên dễ dàng tiếp nhận plasmid tái tổ hợp cũng như quá trình nhân lên và biểu hiện của đoạn gen đó. E. coli có khả năng biểu hiện rất nhiều gen có nguồn gốc
nhân thực và nhân sơ. E. coli có một số promoter mạnh, có khả năng biểu
hiện tốt, tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh. Khả năng tạo sản phẩm cao từ 50 mg/l đến 500 mg/L. Cấu trúc bộ gen của E. coli và đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu khá đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu và sản xuất khi sử dụng E. coli.
Dòng tế bào E. coli được sử dụng trong sản xuất tương đối an tồn, khơng có hoạt tính gây bệnh, ít gây hại ở người và động vật.
1.3.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3)
Chủng biểu hiện E. coli BL21 là chúng khỏe có thể sinh trưởng trong
mơi trường tối thiểu. Hai protease chìa khóa là lon protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào) đã được làm thối hóa. Vì vậy, chúng có ưu điểm là hạn chế được sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lại ổn định hơn trong tế bào sau khi được tổng hợp.
Ngoài những đặc điểm trên, DNA hệ gen của E. coli BL21 có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7. Gen này được đưa vào hệ gen E. coli BL21 và đặt dưới sự điều khiển của promoter lac. T7 RNA polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả năng sao chép hồn tồn bất kỳ một trình tự DNA nào đặt dưới sự kiểm soát của T7 promoter. Chính nhờ những cải biến này mà E. coli BL21 đã trở thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt là những gen được đưa vào hệ vector pET. Chủng E. coli BL21 là một vật chủ biểu hiện thông thường được sử dụng với hầu hết các hệ thống promoter như: lac, trc, tac và araD. Nên đây là một chủng rất tốt để làm vật chủ biểu hiện.
1.3.3. Vector biểu hiện pET32a
Là một kỹ thuật rất hữu ích trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử, công nghệ DNA tái tổ hợp (hoặc nhân bản gen) đề cập đến việc chuyển một đoạn DNA từ một sinh vật sang một phần tử di truyền tự sao chép chẳng hạn như vector biểu hiện. Sau đó, DNA được chèn vào có thể được nhân giống trong tế bào vật chủ nước ngồi hoặc có thể được biểu hiện để tạo ra một protein tái tổ hợp. Nó thuộc về một loại hệ thống biểu hiện có thể tạo ra protein mong muốn khi được kích hoạt sau nó được đưa vào tế bào vật chủ nhân sơ. Tế bào nhân sơ như Escherichia coli là vật chủ ưa thích để biểu hiện các protein ngoại lai vì rẻ tiền, tích lũy sinh khối nhanh chóng và quy trình mở rộng quy trình đơn giản.
Cấu trúc chung của một hệ biểu hiện cần có đặc điểm như chứa đựng promoter mạnh, phù hợp với tế bào biểu hiện, chứa đựng trình tự khởi đầu và trình tự kết thúc của phiên mã, chửa vùng đa nổi với vị trí cắt duy nhất trong vector đối với từng enzyme hạn chế, chứa một đoạn peptid tín hiệu để làm dấu hiệu cho sự tiết của protein tái tổ hợp ra ngoài tế bào chết và mang một vài dấu chuẩn chọn lọc để phục vụ cho mục đích sàng lọc thể biến nạp.
Vector biểu hiện pET32a có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản như một plasmid như sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào (Hình 1.3). Ngoài ra, hệ vector pET32a cịn có nhiều đặc điểm quan trọng, phù hợp cho việc biểu hiện gen như: Gen ngoại lại được
điều khiển bởi T7 promoter đây là promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lại lớn chiếm 10 – 30% tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứng nên có thể điều khiển dễ dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai. Trên vector cịn có vị trí đa tách dịng (Multiplex cloning site-MCS) tạo thuận lợi cho việc ghép nối gen và vector, có trình tự dẫn pelB để đưa protein ra ngồi khoang chu chất, có chỉ thị cho chọn lọc dịng là ampicillin. Q trình phiên mã được điều khiển bởi lac operator, có cơ chế cảm ứng IPTG, Sau vùng đa nổi có đoạn trình tự mã hóa cho 6 amino acid Histidine tiện lợi cho việc tinh sạch protein tái tổ hợp theo phương pháp sắc ký ái lực. Do đó chúng tôi đã lựa chọn vector này để biểu hiện cho protein tái tổ hợp của gen ngoại lai OmpL1 của vi khuẩn Leptospira.
Hình 1.3: Sơ đồ vector pET32a Nguồn: snapgene.com Nguồn: snapgene.com
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tồn bộ các thí nghiệm trong đề tài này được thực hiện tại phịng thí nghiệm của Phịng Hệ gen học vi sinh – Viện Nghiên cứu hệ gen và Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung ương VETVACO.
2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất
2.1.1.1. Nguyên liệu
- 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interogans đang được sử dụng để sản xuất vắc xin tại Việt Nam: L. bataviae, L. canicola, L. grippotyphosa, L. icterohaemorrhagiae, L. pomona do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp.
- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, khỏe mạnh, khối lượng 20 ± 2g, do Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung ương cung cấp.
- Trình tự gen OmpL1 của năm chủng xoắn khuẩn Leptospira interogans đã được nghiên cứu trước đó.
- Vector pJET1.2/blunt (Thermo Fisher), chủng vi khuẩn E. coli DH5α, vector pET32a/blunt, chủng biểu hiện E. coli BL21.
2.1.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng: DreamTad DNA polymerase, dNTP, enzyme cắt giới hạn EcoRV và XhoI, T4 ligase, 1kb DNA Ladder, 6X DNA loading dye (Thermo); Anapure Plasmid Mini kit (Anabio R&D JSC); môi trường LB.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.1.2.1. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu: Máy PCR Veriti (AB); máy soi gel UVP; máy ly tâm lạnh 5424R và 5810R, máy lắc, bể ổn nhiệt, máy đo UV Biospectrometer (Eppendoft); box an toàn sinh học cấp II (ESCO); hệ thống sắc ký tự động AKATAprime Plus (GE Healthcare); tủ lạnh 4oC, -20oC, -80oC, tủ ấm, bộ điện di, máy siêu âm Qsonica.
2.1.2.2. Dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng bao gồm: Đĩa petri; ống falcon: 15ml, 50ml; ống eppendorf: 200 µl, 500 µl, 1,5 ml; ống PCR; pipet: 1-10 µl, 10-100 µl; 100-1000 µl; đầu tip: 10 µl, 200 µl, 1000 µl; lọ penicillin, lọ thủy tinh, bình tam giác: 250ml, 500ml; que cấy.
2.1.2.3. Phần mềm phân tích
- Phần mềm thiết kế mồi Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/);
- Công cụ phân tích dự đốn vị trí quyết định kháng nguyên (epitope) IEDB (http://iedb.org).
- Các phần mềm phân tích trình tự: BioEdit, MEGA6.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế mồi đặc hiệu và PCR nhân gen OmpL1
Trình tự tồn bộ gen OmpL1 của năm chủng xoắn khuẩn Leptospira interogans đã được thu thập trong nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu.
Chúng tơi tiến hành phân tích gen OmpL1, lựa chọn đoạn gen đặc hiệu bằng phần mềm IEDB và thiết kế mồi bằng phần mềm Primer3 [37].
PCR (Polymerase Chain Reaction) được dùng để khuếch đại các đoạn gen mục tiêu phục vụ cho phân tích và thí nghiệm.
Nguyên lý:
Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự phát triển năm 1986. Phương pháp này được ứng dụng trong sinh học phân tử để khuếch đại in vitro số lượng lớn một trình tự DNA bằng enzyme polymerase và một cặp mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) qua phản ứng chuỗi trong một chu kì nhiệt (Mullis et al. , 1986).
Tiến hành:
Gen OmpL1 được nhân bản với các cặp mồi tương ứng (Bảng 2.1) trong phản ứng PCR có thành phần như trong Bảng 2 và chu trình nhiệt ở Bảng 2.2.