Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10X 2 50% PEG 2 T4 ligase 1 Vector 5 Insert 10 Tổng 20
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở 4oC qua đêm và được bảo quản ở -20˚C cho đến khi biến nạp. Phương pháp sốc nhiệt tiếp tục được sử dụng để biến nạp vector pET32a/OmpL1 vào chủng biểu hiện E. coli BL21. Chủng
E.coli đã biến nạp được nuôi qua đêm ở 37oC trên đĩa petri chứa LB đặc có bổ sung 50 µg/ml Amp.
2.2.10. Biểu hiện protein OmpL1 trong E.coli BL21
Chọn một khuẩn lạc E.coli BL21 (đã dược biến nạp vector pET32a/protein OmpL1) trên đĩa cấy, nuôi lắc qua đêm với tốc độ 200 vòng/phút tại 37oC trong 50ml aLB. Trẻ hóa 10ml dịch ni trong 500ml aLB có chứa 34 µg/ml Cm đến khi chỉ số A260 đạt 0,6 – 0,8. Tiếp tục bổ sung 100µl IPTG 1mM và ni ở 37oC, 200 vịng/phút, 4 giờ.
Sau hồn thành nuôi cấy, thu sinh khối tế bào bằng cách li tâm ở 9000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC. Thu tủa và hòa tủa trong đệm Phosphate 0,02M, pH=8. Dịch hòa tủa được bảo quản ở -20oC.
Phương pháp siêu âm được sử dụng để giải phóng protein khỏi tế bào. Dịch hịa tủa được siêu âm 15 lần trên đá, mỗi lần 30 giây. Li tâm dịch này 6000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4oC, thu dịch tan và phần tủa vào hai ống falcon khác nhau. Khi đó, dịch chứa protein được bảo quản ở 4oC cho các bước tiếp theo
2.2.11. Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) PAGE)
Để kiểm tra kích thước và độ tinh sạch của protein, dịch tan được điện di trên gel acrylamide theo phương pháp của Laemmli [43]. Hỗn hợp 15µl dịch tan và 5µl SBB được ủ ở 95oC trong 5 phút rồi đặt ngay lên đá. Tiếp theo tiến hành li tâm 13000 vòng/phút, 24oC, 5 phút trước khi bơm vào giếng điện di. Gel Acrylamide chạy điện di gồm 2 lớp: lớp gel tách 12,5% và lớp gel cô 5%, tỷ lệ thành phần như bảng 2.7.