bệnh. Gen LipL21 được nhân bản bằng PCR từ chủng L. kirschneri serovar Grippotyphosa RM52, sau đó chuyển vào vector biểu hiện pDEST17, trước khi biến nạp vào E. coli BL21-SI. Protein tái tổ hợp được cảm ứng biểu hiện, tinh sạch, kiểm tra, sau đó một lượng 0.25 mg protein được trộn với phụ gia để gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand. Tiêm bổ sung cách mũi đầu 2 tuần, 4 tuần, đến tuần thứ 5 thu lấy kháng huyết thanh từ thỏ. Tiến hành các phương án đánh giá kiểm tra bằng MAT và miễn dịch học trên chuột. Kết quả cho thấy, LipL21 là protein xuất hiện nhiều thứ hai trên bề mặt và được bảo tồn ở các chủng vi khuẩn gây bệnh. Các mẫu chuột nhiễm bệnh và 2/8 mẫu huyết thanh bệnh nhân có phản ứng với protein tái tổ hợp LipL21.
Nhìn chung, khả năng kích thích miễn dịch cụ thể trong mô hình động vật được tạo thành do OmpL1 có khả năng gắn kết với các thành phần ma trận ngoại bào (ECM) và các thành phần khác trong huyết thanh dựa trên sự liên kết với laminin và fibronectin huyết tương [25]. Do đó, OmpL1 là một protein tiềm năng cho điều chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh Leptospirosis.
1.2.3. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira Leptospira
Màng ngoài của Leptospira bao gồm phospholipid, protein màng ngoài (OMP) và lipopolysacarit (LPS) hoạt động như nội độc tố.Trong máu, sự gắn kết LPS với các thụ thể trên bề mặt tế bào lympho B dẫn đến việc kích hoạt các tế bào B và sản xuất IgM chống lại LPS của Leptospira. IgM có thể làm giảm vi khuẩn và thúc đẩy quá trình thực bào của chúng và tiêu diệt bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào. Những xoắn khuẩn sống sót sau phản ứng miễn dịch này có thể tránh được sự giết chết qua trung gian bổ sung và nhanh
chóng phổ biến và xâm chiếm gan và các cơ quan đích chính khác của chúng là phổi và thận. Ở gan và thận, LPS liên kết với TLR2 và TLR4 gây ra kích hoạt tế bào lymphoB và tế bào lympho T. Các tế bào này hoạt hóa tiết ra interferon-γ thúc đẩy việc tiêu diệt Leptospira, nhưng cũng tạo ra các cytokine gây viêm như interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u (TNF) dẫn đến viêm mô, TNF và IL-6 cũng là những chất trung gian quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của nhiễm trùng não mô cầu, nhưng trao đổi huyết tương có ảnh hưởng nhỏ hoặc không có trong nồng độ trong huyết tương của các cytokine này ở bệnh nhân nhiễm trùng não mô cầu. Sinh lý bệnh của tổn thương phổi trong Leptospirosis nghiêm trọng cũng không rõ ràng và được cho là do độc tố không xác định hoặc do cơ chế tự miễn dịch, có sự lắng đọng của IgM, IgA, IgG và C3 trong phế nang của bệnh nhân xuất huyết phổi thứ phát sau Leptospirosis.
Năm 2004, Sohini Dey và cộng sự đã làm kháng huyết thanh của protein tái tổ hợp LipL32 sử dụng ELISA để phát hiện bệnh Leptospirosis [26]. Gen mã hóa protein LipL32 từ chủng L. interrogans serovar Pomona được nhân lên bằng phản ứng PCR với cặp mồi là đoạn trình tự tương ứng từ 130-150 và 757-778 ở chủng L. kirschneri LipL32 bổ sung trình tự enzyme cắt giới hạn. Sau đó, đoạn gen này được chuyển vào vector biểu hiện pProEXHTa (Life Technologies) trước khi biến nạp vào E. coli DH5α. Nồng độ 1 mM của IPTG là điều kiện cảm ứng nhằm thu được protein tái tổ hợp LipL32 gắn thêm đuôi 6-Higtag, sau đó tinh sạch qua cột sắc ký ái lực. Protein thu được được kiểm tra bằng SDS-PAGE, tinh sạch và đo nồng độ bằng phương pháp Biure [12]. Có 137 mẫu huyết thanh chó được thu thập, sàng lọc và thực hiện xét nghiệm MAT cho tỉ lệ ngưng kết lơn hơn hoặc bằng 1:100 đạt 64/137 mẫu. Tiến hành phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên LipL32 tái tổ hợp (nồng độ mỗi giếng 0.5 ng-1500 ng) với 137 mẫu huyết thanh. Pha loãng các mẫu huyết thanh với tỉ lệ 1:125 trong PBST, và tiếp tục được pha loãng từ 1:125 đến 1: 16000 trong các giếng. Độ đặc hiệu, độ nhạy tương đối và độ chính xác của ELISA được so sánh với MAT theo các công thức được mô tả trong nghiên cứu này [26]. Kết quả cho thấy phương pháp
ELISA pha loãng với một nồng độ duy nhất trong nghiên cứu này có độ nhạy 97% và cho tỉ lệ MAT lớn hơn 100 ở các chủng serovar khác nhau. Protein tái tổ hợp LipL32 hoạt động như một kháng nguyên đích cho chẩn đoán huyết thanh ở bệnh Leptospitosis [26]. Cấu trúc protein LipL32 nguyên bản cũng được báo cáo đầy đủ bởi Vivian và cộng sự năm 2009 [27]. Một nghiên cứu khác của Hartwig và cộng sự năm 2010 khảo sát việc biểu hiện protein tái tổ hợp LipL32 từ chủng L. interrogans serovar Copenhageni Fiocruz L1-130 sử dụng vector biểu hiện pPICZαB (Invitrogen) và biểu hiện trên nấm men P. pastoris cho lượng lớn 285 mg/L.
Năm 2006, Mariya và cộng sự đã khảo sát khả năng gây miễn dịch bằng kháng nguyên tái tổ hợp LipL41 từ chủng L. interrogans serovar Canicola gây bệnh ở bò bằng phương pháp ELISA [28]. Gen mã hóa cho LipL41 được gắn vào vector biểu hiện pPROEXHTb (Life Technologies) và được biến nạp vào trong E. coli DH5α, sau đó cảm ứng bằng IPTG nồng độ 1mM, thu qua cột sắc ký ái lực, thẩm tách, tinh sạch. Sau đó, tiến hành đánh giá bằng phương pháp ELISA và MAT theo công thức được công bố trong nghiên cứu. Kết quả cho thấy, protein tái tổ hợp LipL41 thu được sau tinh sạch tổng cộng 19,6 mg/5 lít môi trường. Độ đặc hiệu lên đến 85,3%.
Zhang và cộng sự đã biểu hiện và phân tích so sánh các gen mã hóa cho protein màng ngoài LipL21, LipL32 và OmpL1 của các chủng gây bệnh Leptospitosis [29, 30]. Một phần trong nghiên cứu được ghi lai như sau: các gen màng ngoài được PCR từ 17 chủng Leptospira, sau đó được tích hợp và vector biểu hiện pET-28(+) (Novagen) và biểu hiện trong E. coli BL21(DE3) (Novagen), cảm ứng biểu hiện bằng IPTG nồng độ 1 mM. Các protein tái tổ hợp thu được được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực liên kết với đuôi Histag. Protein tinh sạch được gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand với lượng mỗi liều tiêm là 0.2 mg, mũi tiếp theo cách mũi đầu 4 tuần và 6 tuần. Đến tuần thứ 8, thỏ được thu lấy huyết thanh và được kiểm tra bằng ELISA với các kháng nguyên tái tổ hợp được tinh sạch. Kết quả cho thấy, gen mã hóa protein LipL21 được bảo tồn cao ở các chủng vi khuẩn gây bệnh nhưng
không cho kết quả gây miễn dịch đáng kể thông qua phản ứng ELISA [30]. Mặt khác, Cullen và cộng sự năm 2003, đã nghiên cứu, đánh giá biểu hiện ở các chủng Leptospira gây bệnh [31]. Gen lipL21 được nhân bản bằng PCR từ chủng L. kirschneri serovar Grippotyphosa RM52, sau đó chuyển vào vector biểu hiện pDEST17, trước khi biến nạp vào E. coli BL21-SI. Protein tái tổ hợp được cảm ứng biểu hiện, tinh sạch, kiểm tra, sau đó một lượng 0.25 mg protein được trộn với phụ gia để gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand. Tiêm bổ sung cách mũi đầu 2 tuần, 4 tuần, đến tuần thứ 5 thu lấy kháng huyết thanh từ thỏ. Tiến hành các phương án đánh giá kiểm tra bằng MAT và miễn dịch học trên chuột. Kết quả cho thấy, LipL21 là protein xuất hiện nhiều thứ hai trên bề mặt và được bảo tồn ở các chủng vi khuẩn gây bệnh. Các mẫu chuột nhiễm bệnh và 2/8 mẫu huyết thanh bệnh nhân có phản ứng với protein tái tổ hợp LipL21 [31].
Năm 2002, Lig A được mô tả như một globulin miễn dịch giống protein, sau đó các phản ứng miễn dịch của protein Lig A, Lig B cũng được xác nhận [32]. Theo nghiên cứu của Palaniappan và cộng sự năm 2004, gen mã hóa cho LigA và Lig B được nhân lên bằng phản ứng PCR từ L. interrogans, sau đó tích hợp vào vector pGEX4T-2 trước khi biến nạp vào E. coli BL21(DE3) để tiến hành cảm ứng biểu hiện sử dụng IPTG nồng độ 1 mM. Các protein tái tổ hợp được thu lại bằng cột sắc ký ái lực, tinh sạch. Tiến hành gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand trưởng thành với nồng độ 0.1 mg protein tái tổ hợp. Thỏ được tiêm bổ sung cùng liều vào ngày thứ 19 và 35 sau mũi tiêm đầu. Đến ngày thứ 45, kháng huyết thanh thỏ được thu lại để phân tích. Kết quả cho thấy, các gen lig chỉ xuất hiện ở các chủng vi khuẩn gây bệnh mà không có ở các chủng không gây bệnh trong nghiên cứu. Với việc sử dụng đối chứng là huyết thanh từ vắc-xin tế bào bất hoạt cho chó trong phản ứng động học ELISA (kinetic ELISA, viết tắt là KELA), đã cho thấy không có kháng thể kháng protein tái tổ hợp xuất hiện khi sử dụng vắc- xin. Thông qua xét nghiệm kiểm tra KELA cho 67 mẫu huyết thanh với tỉ lệ
MAT lớn hơn 1600, thu được mức độ đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp LigA và LigB lần lượt là 41% và 35 % có tiềm năng định hướng vắc-xin phòng bệnh [33]. Năm 2008, Faisal và cộng sự đã nghiên cứu khả năng gây miễn dịch của protein tái tổ hợp LigA trên chuột hamster [34]. Một trong những kết quả được thể hiện ở bảng sau. Hiệu quả bảo vệ sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp LigA sau 28 lây nhiễm ở nhóm sử dụng đạt 100%, 100%, 100% trong khi đối chứng lần lượt đạt 50%, 75%, 62,5%