CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tồn bộ các thí nghiệm trong đề tài này được thực hiện tại phịng thí nghiệm của Phịng Hệ gen học vi sinh – Viện Nghiên cứu hệ gen và Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung ương VETVACO.
2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất
2.1.1.1. Nguyên liệu
- 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interogans đang được sử dụng để sản xuất vắc xin tại Việt Nam: L. bataviae, L. canicola, L. grippotyphosa, L. icterohaemorrhagiae, L. pomona do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp.
- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, khỏe mạnh, khối lượng 20 ± 2g, do Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung ương cung cấp.
- Trình tự gen OmpL1 của năm chủng xoắn khuẩn Leptospira interogans đã được nghiên cứu trước đó.
- Vector pJET1.2/blunt (Thermo Fisher), chủng vi khuẩn E. coli DH5α, vector pET32a/blunt, chủng biểu hiện E. coli BL21.
2.1.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng: DreamTad DNA polymerase, dNTP, enzyme cắt giới hạn EcoRV và XhoI, T4 ligase, 1kb DNA Ladder, 6X DNA loading dye (Thermo); Anapure Plasmid Mini kit (Anabio R&D JSC); môi trường LB.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.1.2.1. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu: Máy PCR Veriti (AB); máy soi gel UVP; máy ly tâm lạnh 5424R và 5810R, máy lắc, bể ổn nhiệt, máy đo UV Biospectrometer (Eppendoft); box an toàn sinh học cấp II (ESCO); hệ thống sắc ký tự động AKATAprime Plus (GE Healthcare); tủ lạnh 4oC, -20oC, -80oC, tủ ấm, bộ điện di, máy siêu âm Qsonica.
2.1.2.2. Dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng bao gồm: Đĩa petri; ống falcon: 15ml, 50ml; ống eppendorf: 200 µl, 500 µl, 1,5 ml; ống PCR; pipet: 1-10 µl, 10-100 µl; 100-1000 µl; đầu tip: 10 µl, 200 µl, 1000 µl; lọ penicillin, lọ thủy tinh, bình tam giác: 250ml, 500ml; que cấy.
2.1.2.3. Phần mềm phân tích
- Phần mềm thiết kế mồi Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/);
- Công cụ phân tích dự đốn vị trí quyết định kháng nguyên (epitope) IEDB (http://iedb.org).
- Các phần mềm phân tích trình tự: BioEdit, MEGA6.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế mồi đặc hiệu và PCR nhân gen OmpL1
Trình tự tồn bộ gen OmpL1 của năm chủng xoắn khuẩn Leptospira interogans đã được thu thập trong nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu.
Chúng tơi tiến hành phân tích gen OmpL1, lựa chọn đoạn gen đặc hiệu bằng phần mềm IEDB và thiết kế mồi bằng phần mềm Primer3 [37].
PCR (Polymerase Chain Reaction) được dùng để khuếch đại các đoạn gen mục tiêu phục vụ cho phân tích và thí nghiệm.
Nguyên lý:
Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự phát triển năm 1986. Phương pháp này được ứng dụng trong sinh học phân tử để khuếch đại in vitro số lượng lớn một trình tự DNA bằng enzyme polymerase và một cặp mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) qua phản ứng chuỗi trong một chu kì nhiệt (Mullis et al. , 1986).
Tiến hành:
Gen OmpL1 được nhân bản với các cặp mồi tương ứng (Bảng 2.1) trong phản ứng PCR có thành phần như trong Bảng 2 và chu trình nhiệt ở Bảng 2.2.
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Nồng độ Thể tích
DreamTaq DNA polymerase 5 U/µl 0.2 µl
DreamTaq Buffer 5X 2 µl
dNTP 2,5 mM 2 µl
Mồi xi 10 pmol/µl 0,5 µl
Mồi ngược 10 pmol/µl 0,5 µl
DNA khn 50 – 100 ng/µl 2 µl
H2O 12,8 µl
Tổng thể tích 20 µl
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
30 chu kỳ
Nhiệt độ 94°C 94°C 56°C 72°C 72°C 4°C
Thời gian 5 min 30s 30s 45s 7 min ∞
Bảng 2.3: Trình tự mồi khuếch đại tồn bộ gen OmpL1
Tên mồi Trình tự Kích thước (bp) Full-OMPL1-F 5’ CCCGGATCCAGCCTAAGTGCAAAAACATATGC 3’ 963 Full-OmpL1-R 5’ CGCAAGCTTITAGAGTTCGTGTTTATAACC 3’
2.2.2. PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR)
Nguyên lý:
Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA được thay thế bằng DNA plasmid được giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94°C đến 95°C, màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp.
Plasmid tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu, hoặc mồi vector.
Tiến hành:
Hòa tan tế bào vi khuẩn trong 25 ul nước khử ion. Sau đó sử dụng 5 ul hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện như mô tả tại mục 2.2.1.
2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Điện di trên gel agarose là phương pháp được sử dụng để phân tách các phân tử DNA có kích thước khác nhau dưới tác dụng của điện trường. Do phân tử DNA tích điện âm nên khi bị đặt trong 1 điện trường đều thì chúng sẽ dịch chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường. Gel agarose có cấu tạo là một hệ thống các sợi polysaccarit nên sẽ cản trở đường đi của DNA. Phân tử DNA có kích thước càng lớn thì di chuyển càng chậm và ngược lại.
Tiến hành:
Pha gel agarose 1% gồm 1 g agarose cho vào 100 ml đệm TAE, khuấy đều, ngâm cho agarose nở trong 20 phút rồi đun trong lò vi sóng cho agarose tan hết. Sau đó làm nguội gel xuống khoảng 50°C thì đổ gel vào khn và lắp lược. Khi gel nguội thì rút lược và dặt bản gel vào buồng điện di. Đổ dung dịch đệm vào sao cho dung dịch đệm cao hơn mặt bản gel 2-5 mm. Sau đó trộn DNA với loading dye và tra vào các giếng cũng với marker theo các thể tích thích hợp. Sau khi tra mẫu thì cắm điện cực, bắt đầu chạy điện di với điện thế 100 V trong 40 phút. Sau khi kết thúc quá trình điện di, đưa bản gel vào
nhuộm trong Ethidium Bromide trong khoảng 5 phút rồi soi tia UV để xem kết quả.
2.2.4. Xác định trình tự acid nucleic
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn được giải trình tự theo nguyên lý của Sanger (1977) dựa trên các dideoxynucleotide [38]. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp vào đầu 3'-OH, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang khơng có nhóm 3'-OH phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Nồng độ của mỗi didcoxynucleotide được xác định thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và khơng gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide [39].
Plasmid nhân dòng pJET1.2/OmpL1, plasmid biểu hiện pET32a)/OmpL1 tinh sạch theo phương pháp chuẩn dùng làm khuôn chạy PCR để đọc trình tự trên máy dọc trình tự tự động ABI 3500. Phần mềm Bioedit và BLAST được sử dụng phân tích, so sánh trình tự nucleotide và amino acid.
2.2.5. Gắn đoạn gen vào vector nhân dòng
Nguyên lý:
pJET1.2 là vector chọn lọc có kích thước 2974 bp, có khả năng tiếp nhận các đoạn chèn có kích thước từ 6 bp đến 10 kb. Đầu 5’ của vị trí tách dòng chứa các nhóm phosphoryl, do đó, khơng cần phosphoryl hóa các mồi PCR. Vector pJET1.2 nếu không được chèn đoạn DNA ngoại lai sẽ biểu hiện enzyme giới hạn Eco47IR gây chết và khơng hình thành khuẩn lạc trên môi
trường ni cấy sau q trình biến nạp. Do đó, chỉ có những dịng tái tổ hợp chứa đoạn chèn mới phát triển được trên môi trường nuôi cấy.
Sản phẩm PCR thu được có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 bằng kit CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher)[40]. Thành phần phản ứng như Bảng 2.4:
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 6
2X reaction buffer 10 DNA Blunting Enzyme 1
Sản phẩm PCR 1
pJET1.2/blunt cloning
vector (50ng/µl) 1
T4 DNA Ligase 1
Tổng 20
Thực hiện phản ứng cắt tạo đầu bằng trên đá với thành phần phản ứng gồm 10 µl 2X Reaction Buffer, 1 µl sản phẩm PCR sau tinh sạch, thêm nước khử ion đến thể tích 17 µl sau đó bổ sung 1 µl DNA Blunting Enzyme. Hỗn hợp phản ứng được làm tan trong thời gian ngắn và li tâm trong 3 đến 5 giây và tiếp tục ủ ở 70°C trong 5 phút rồi cắm vào đá. Thêm 1 µl vector nhân dịng pJET1.2/blunt (50 ng/ml) và 1 µl T4 DNA Ligase vào ống phản ứng, làm tan nhẹ rồi li tâm 3 đến 5 giây. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 5 phút và giữ ở -20oC cho đến khi biến nạp.
2.2.6. Biến nạp vào tế bào E. coli khả biến
Nguyên lý:
Vector pJET1.2-OmpL1 được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli
DH5α và BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt [41]. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được xử lý bằng CaCl2, giúp DNA dễ dàng bám dính vào
màng tế bào, q trình thay đổi đột ngột về nhiệt độ sẽ tác động lên cấu trúc thành tế bào, tạo điều kiện cho DNA ngoại lai đi vào trong tế bào.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 4 ml LB
lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Chuyển 1 ml dịch nuôi vào bình 100 ml LB lỏng, tiếp tục ni lắc ở 37°C trong 3-3,5 giờ để đạt OD600nm 0,5- 0,6. Dịch nuôi cấy để lạnh hoặc cắm trong đá 10 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Thu cặn tế bào, úp ngược ống trên giấy phơi khô trong 1 phút. Hòa tế bào bảng cách khuấy hoặc Vortex nhẹ trong 30 ml dung dịch MgCl2- CaCl2, lạnh (80 mM MgCl2; 20 mM CaCl2). Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C để thu cặn tế bào, sau đó úp ngược phơi khô trong 1 phút. Tiếp tục hỏa tế bào trong 2 ml CaCl2 0,1M với 50 ml môi trường gốc. Sử dụng tế bào này cho biến nạp, nếu chưa dùng ngay thì bổ sung glycerol 70% theo tỷ lệ 2 CaCly: 1 glycerol 70% rồi đặt vào tủ âm 80 để dùng dần.
Thực hiện: Tế bào E.coli được rã đông trên đá 10-20 phút. Hỗn hợp
chứa đoạn gen OmpL1 được bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút, sau đó cho vào bể ủ 42oC trong 45 giây rồi chuyển ngay lên đá 2 phút. 300-500 µl mơi trường LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó được giữ ở 37oC trong 10 phút và tiếp tục lắc ở 150 vòng/phút, 37oC trong 50 phút. 50-100 µl hỗn hợp biến nạp được cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa môi trường LB đặc có 50 µg/ml ampicillin (Amp), và ni trong tủ ấm 37oC qua đêm. Khuẩn lạc ngẫu nhiên thu được tiếp tục được nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50 µg/ml Amp (aLB).
2.2.7. Tách chiết và định lượng DNA plasmid
Sử dụng bộ kit Anapure plasmid mini kit để tách DNA plasmid, các thao tác thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit.
Thực hiện: Ly tâm 1-1,5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn (OD600nm tối ưu: 0.8
– 1.2) ở tốc độ 7.000 rpm trong 1 phút để thu tủa tế bào, sau đó hịa tủa trong 150 µl Resuspension Buffer và Vortex mẫu trong 10-15 giây. Thêm vào dung dịch 200 ml Lysis Buffer, trộn đều bằng đảo xuôi-ngược ống 5-6 lần. Tiếp tục thêm 350 ul Binding Buffer đảo xuôi-ngược ống cho đến khi xuất hiện kết tủa trắng. Ly tâm ở tốc độ tối đa 12.000 rpm trong 10 phút. Hút 700 ul dịch nổi
chuyển sang cột lọc đặt trên ống thu dịch sau đó ly tâm cột lọc-ống thu dịch ở tốc độ tối đa 12.000 rpm trong 1 phút và đổ bỏ dịch chảy qua cột. Thêm 500µl Washing Buffer (WB) vào cột lọc và ly tâm cột lọc-ống thu dịch ở 12.000 rpm trong 2 phút để bại bỏ hoàn toàn đệm rủa. Tiến hành ly tâm cột lọc-ống thu dịch ở 12.000 rpm trong 4 phút rồi đổ bỏ dịch chảy qua cột. Nhấc cột lọc chuyển sang ống epp 1,5 ml vô trùng mới sau đó thêm 50-100 ul Elution Buffer vào trung tâm của cột lọc. Cuối cùng ly tâm cột lọc-ống eppendorf ở tốc độ tối đa 12.000 rpm trong 1 phút. Kiểm tra chất lượng bằng thiết bị đo UV.
2.2.8. Xử lý enzyme cắt giới hạn
Enzym cắt giới hạn là các endonuclease nội bào có khả năng nhận dạng một trình tự DNA ngắn rồi cắt cả hai mạch ở vị trí đặc thù trong nội tại đoạn nhận biết hoặc tại vị trí lân cận đoạn nhận biết. Các enzym này phá vỡ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch kép mà không gây tổn hại các base. Để kiểm tra dịng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, các plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc được cắt bằng các enzym giới hạn. Các enzym này được thiết kế ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai.
Hai vector pJET1.2/OmpL1 và pET32a được xử lý bằng cặp enzyme cắt giới hạn XhoI và EcoRV để tạo ra các đầu dính tương ứng [42]. Thành
phần phản ứng như bảng 2.5. Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt vector Thành phần Thể tích (µl) Đệm R 10 Vector 50 XhoI 5 EcoRV 5 H2O 30 Tổng thể tích 100
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ ở 37oC qua đêm, tạo sản phẩm cắt hoàn toàn. Sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và bảo quản ở -20˚C cho đến khi sử dụng.
2.2.9. Gắn gen vào vector biểu hiện pET32a
Gen mã hóa protein OmpL1 được gắn vào vector pET32a bằng enzyme T4 ligase tạo ra plasmid pET32a/OmpL1. Vector này có chứa các vùng kích thích biểu hiện protein giúp việc việc biểu hiện đạt hiệu suất cao. Thành phần phản ứng như bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phẩn phản ứng nối gen vào vetor
Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10X 2 50% PEG 2 T4 ligase 1 Vector 5 Insert 10 Tổng 20
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở 4oC qua đêm và được bảo quản ở -20˚C cho đến khi biến nạp. Phương pháp sốc nhiệt tiếp tục được sử dụng để biến nạp vector pET32a/OmpL1 vào chủng biểu hiện E. coli BL21. Chủng
E.coli đã biến nạp được nuôi qua đêm ở 37oC trên đĩa petri chứa LB đặc có bổ sung 50 µg/ml Amp.
2.2.10. Biểu hiện protein OmpL1 trong E.coli BL21
Chọn một khuẩn lạc E.coli BL21 (đã dược biến nạp vector pET32a/protein OmpL1) trên đĩa cấy, nuôi lắc qua đêm với tốc độ 200 vòng/phút tại 37oC trong 50ml aLB. Trẻ hóa 10ml dịch ni trong 500ml aLB có chứa 34 µg/ml Cm đến khi chỉ số A260 đạt 0,6 – 0,8. Tiếp tục bổ sung 100µl IPTG 1mM và ni ở 37oC, 200 vịng/phút, 4 giờ.
Sau hồn thành ni cấy, thu sinh khối tế bào bằng cách li tâm ở 9000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC. Thu tủa và hòa tủa trong đệm Phosphate 0,02M, pH=8. Dịch hòa tủa được bảo quản ở -20oC.
Phương pháp siêu âm được sử dụng để giải phóng protein khỏi tế bào. Dịch hòa tủa được siêu âm 15 lần trên đá, mỗi lần 30 giây. Li tâm dịch này 6000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4oC, thu dịch tan và phần tủa vào hai ống falcon khác nhau. Khi đó, dịch chứa protein được bảo quản ở 4oC cho các bước tiếp theo
2.2.11. Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) PAGE)
Để kiểm tra kích thước và độ tinh sạch của protein, dịch tan được điện di trên gel acrylamide theo phương pháp của Laemmli [43]. Hỗn hợp 15µl dịch tan và 5µl SBB được ủ ở 95oC trong 5 phút rồi đặt ngay lên đá. Tiếp theo tiến hành li tâm 13000 vòng/phút, 24oC, 5 phút trước khi bơm vào giếng điện di. Gel Acrylamide chạy điện di gồm 2 lớp: lớp gel tách 12,5% và lớp gel cô 5%, tỷ lệ thành phần như bảng 2.7.
Bảng 2.7: Thành phần gel Acrylamide
Thành phần Gel tách 12,5% Gel cô 5%
Dung dịch acrylamide 30% 2,000 ml 0,40625 ml 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 1,250 ml 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 0,625 ml Nước cất 1,750 ml 1,444 ml APS 10% 0,040 ml 0,040 ml TEMED 0,007 ml 0,010ml
Sử dụng đệm Tris-glycine pH 8,8 chứa SDS 1% và hiệu điện thế 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm. Bản gel điện di được nhuộm với dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn
hợp methanol:axetic:nước với tỉ lệ thể tích là 3:1:6 khoảng 20 phút. Gel được tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.