CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP OmpL1
3.2.1. Chuyển gen OmpL1 vào vector biểu hiện pET32a
Sau khi đã có được lượng lớn vi khuẩn E. coli DH5α mang vector pJET1.2/Ompl1 chúng tôi đã thực hiện tách DNA plasmid từ dịch nuôi vi khuẩn này bằng bộ kit Anapure Plasmid Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm sau tách chiết được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1% như Hình 3.8.
Hình 3.8: Điện di đồ sản phẩm plasmid
(1) L. bataviae, (2) L. canicola, (3) L. grippotyphosa, (4) L. icterohaemorrhagiae, (5) L. pomona
Từ kết quả điện di thấy rằng sản phẩm thu được là một bằng có kích thước khoảng 3.5kb được dự đoán là plasmid pJET1.2/OmpL1. Tiếp theo, plasmid này được cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn XhoI và EcoRV. Trong
quá trình này, đoạn gen OmpL1 được cắt ra khỏi vector pJET1.2 đồng thời được tạo đầu so le với XhoI và đầu bằng với EcoRV phục vụ việc gắn vào
vector biểu hiện ở bước sau.
Đồng thời, chúng tôi cũng thực hiện cắt mở vòng vector biểu hiện pET32a bằng hai enzyme XhoI và EcoRV để tạo đầu dính tương ứng theo quy trình đã nêu ở mục 2.2.5. Vector pET32a có kích thước 6099bp sau khi được cắt bằng enzyme sẽ loại bỏ một đoạn 48bp, như vậy theo lý thuyết sẽ có một băng tương đương với băng plasmid đầu và một băng ở vị trí nhỏ hơn 100bp trên điện di đồ khi kiểm tra trên gel Agarose 1%. Kết quả cắt bằng enzyme giới hạn được thể hiện trong Hình 3.9.
Hình 3.9: Điện di đồ sản phẩm cắt mở vòng vector pET32a M: 1kb Ladder;(1) Sản phẩm cắt; (2) vector pET32a nguyên bản M: 1kb Ladder;(1) Sản phẩm cắt; (2) vector pET32a nguyên bản
Hình ảnh điện di cho thấy băng sản phẩm sau khi cắt mảnh, rõ nét, khơng có vệt và có kích thước nhỏ hơn một chút so với plasmid ban đầu. Như
vậy, quá trình cắt đã được thực hiện thành công. Sau đó, hai sản phẩm cắt pJET1.2 và pET32a được tinh sạch và ghép nối với nhau bằng enzyme gắn T7 ligase ở 4°C và để qua đêm nhằm tạo vector tái tổ hợp pET32a mang đoạn gen OmpL1 (kí hiệu pET32a/OmpL1). Plasmid này sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi cấy trên đĩa mơi trường thạch LB có bổ sung Ampicillin (Hình 3.10).
Hình 3.10: Khuẩn lạc E.coli đã được biến nạp vector pET32a/OmpL1 trên mơi trường LB.
Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi T7 M: 1kb Ladder; (1-15): Khuẩn lạc số 1 – số 15 M: 1kb Ladder; (1-15): Khuẩn lạc số 1 – số 15
Sau q trình ni qua đêm ở 37°C, một số lượng lớn khuẩn lạc đã được tạo ra. 15 khuẩn lạc được lựa chọn để thực hiện phản ứng PCR trực tiếp
với cặp mồi T7 promoter Fw và T7 terminater Rv. Theo lý thuyết, sau phản ứng sẽ thu được băng sản phẩm có kích thước 1.4kb. Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 3.11).