Tên mồi Trình tự (5’-3’) Kích thước (bp) Nhiệt độ bắt cặp OmpL1-R-Fw CCTGCTGATATCAGATTAATCACCCTTGATAG 650 55°C OmpL1-R-Rw TTAGAGCTCGAGTTTATAACCGAATCTGTAGA 55°C
3.1.3. Nhân dòng đoạn gen OmpL1 vào vector pJET1.2
(1) L. bataviae, (2) L. canicola, (3) L. grippotyphosa, (4) L. icterohaemorrhagiae, (5) L. Pomona, (6) Đối chứng âm
Trước khi thực hiện nhân dịng, Đoạn gen mã hóa cho kháng ngun OmpL1 được khuếch đại từ DNA tổng số của 5 chủng Leptospira bằng kỹ
thuật PCR theo mô tả trong phần phương pháp. Kết quả đã thu được 1 băng sản phẩm duy nhất, rõ nét và khơng có vạch phụ kèm theo, có kích thước khoảng 650bp phù hợp với tính tốn lý thuyết của cặp mồi đã thiết kế (Hình 3.6). Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch, xử lý hai đầu và gắn vào vector pJET1.2 bằng enzyme T4 ligase để hình thành plasmid tái tổ hợp pJET/OmpL1 và biến nạp vào chủng khả biến E. coli DH5α. Các khuẩn lạc được nuôi cấy và tách DNA plasmid để cắt kiểm tra bằng hai enzyme cắt giới hạn XhoI và EcoRV để chắc chắn vector mang đoạn gen đích.
Q trình tách DNA plasmid từ dịch ni vi khuẩn sử dụng bộ Anapure plasmid mini kit và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 3.7).
Hình 3.7: Điện di đồ sản phẩm cắt vector pJET1.2/OmpL1
(1) Vector pJET1.2/OmpL1; (2) Sản phẩm của quá trình cắt bằng enzyme XhoI và EcoRV.
Kết quả cho thấy xuất hiện hai băng DNA mảnh, rõ nét, trong đó một băng có kích thước ngắn hơn plasmid trước khi cắt một đoạn rất nhỏ được dự đốn là sản phẩm cịn lại của plasmid sau q trình cắt. Băng cịn lại có kích thước khoảng 650bp tương đương với đoạn gen OmpL1 được thiết kế. Như vậy, quá trình cắt đã được thực hiện thành công, phù hợp với tính tốn lý thuyết và sản phẩm cắt đạt chất lượng tốt, có thể sử dụng cho các bước tiếp theo
3.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP OmpL1
3.2.1. Chuyển gen OmpL1 vào vector biểu hiện pET32a
Sau khi đã có được lượng lớn vi khuẩn E. coli DH5α mang vector pJET1.2/Ompl1 chúng tôi đã thực hiện tách DNA plasmid từ dịch nuôi vi khuẩn này bằng bộ kit Anapure Plasmid Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm sau tách chiết được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1% như Hình 3.8.
Hình 3.8: Điện di đồ sản phẩm plasmid
(1) L. bataviae, (2) L. canicola, (3) L. grippotyphosa, (4) L. icterohaemorrhagiae, (5) L. pomona
Từ kết quả điện di thấy rằng sản phẩm thu được là một bằng có kích thước khoảng 3.5kb được dự đoán là plasmid pJET1.2/OmpL1. Tiếp theo, plasmid này được cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn XhoI và EcoRV. Trong
quá trình này, đoạn gen OmpL1 được cắt ra khỏi vector pJET1.2 đồng thời được tạo đầu so le với XhoI và đầu bằng với EcoRV phục vụ việc gắn vào
vector biểu hiện ở bước sau.
Đồng thời, chúng tôi cũng thực hiện cắt mở vòng vector biểu hiện pET32a bằng hai enzyme XhoI và EcoRV để tạo đầu dính tương ứng theo quy trình đã nêu ở mục 2.2.5. Vector pET32a có kích thước 6099bp sau khi được cắt bằng enzyme sẽ loại bỏ một đoạn 48bp, như vậy theo lý thuyết sẽ có một băng tương đương với băng plasmid đầu và một băng ở vị trí nhỏ hơn 100bp trên điện di đồ khi kiểm tra trên gel Agarose 1%. Kết quả cắt bằng enzyme giới hạn được thể hiện trong Hình 3.9.
Hình 3.9: Điện di đồ sản phẩm cắt mở vịng vector pET32a M: 1kb Ladder;(1) Sản phẩm cắt; (2) vector pET32a nguyên bản M: 1kb Ladder;(1) Sản phẩm cắt; (2) vector pET32a nguyên bản
Hình ảnh điện di cho thấy băng sản phẩm sau khi cắt mảnh, rõ nét, khơng có vệt và có kích thước nhỏ hơn một chút so với plasmid ban đầu. Như
vậy, quá trình cắt đã được thực hiện thành công. Sau đó, hai sản phẩm cắt pJET1.2 và pET32a được tinh sạch và ghép nối với nhau bằng enzyme gắn T7 ligase ở 4°C và để qua đêm nhằm tạo vector tái tổ hợp pET32a mang đoạn gen OmpL1 (kí hiệu pET32a/OmpL1). Plasmid này sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi cấy trên đĩa môi trường thạch LB có bổ sung Ampicillin (Hình 3.10).
Hình 3.10: Khuẩn lạc E.coli đã được biến nạp vector pET32a/OmpL1 trên mơi trường LB.
Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi T7 M: 1kb Ladder; (1-15): Khuẩn lạc số 1 – số 15 M: 1kb Ladder; (1-15): Khuẩn lạc số 1 – số 15
Sau q trình ni qua đêm ở 37°C, một số lượng lớn khuẩn lạc đã được tạo ra. 15 khuẩn lạc được lựa chọn để thực hiện phản ứng PCR trực tiếp
với cặp mồi T7 promoter Fw và T7 terminater Rv. Theo lý thuyết, sau phản ứng sẽ thu được băng sản phẩm có kích thước 1.4kb. Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 3.11).
3.2.2. Biểu hiện protein OmpL1 tái tổ hợp
Để biểu hiện gen trong E. coli, plasmid tái tổ hợp pET32a/protein
OmpL1 được biến nạp vào E. coli BL21 và biểu hiện. Quy trình biến nạp
được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp. Protein tổng số thu được sau biểu hiện được điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE. Theo tính tốn lý thuyết, đoạn gen OmpL1 được biểu hiện dưới dang protein tái tổ hợp sẽ có khối lượng phân tử khoảng 38 kDa. Kết quả trên đường chạy có IPTG trong Hình 3.12 cho thấy, dịng tế bào tái tổ hợp mang gen OmpL1 tổng hợp một protein ngoại lai có khối lượng phân tử đúng theo tính tốn lý thuyết.
Hình 3.12: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện protein OmpL1 ở E. coli BL21 BL21
(1): Protein tổng số của E. coli BL21 mang vector pET32a /OmpL1 không cảm ứng IPTG, (2): Protein tổng số của E.coli BL21 mang vector pET32a/OmpL1 cảm ứng IPTG ở dạng không tan, (3): Protein tổng số của
Đối với dịng đối chứng âm khơng được cảm ứng IPTG khơng biểu hiện được băng có kích thước như vậy. Để kiểm tra protein đang nghiên cứu ở dạng tan hay không tan, chúng tôi tiến hành siêu âm sinh khối E. coli trong
đệm PBS, ly tâm thu dịch pha trên, pha cặn, sau đó tiến hành xử lý mẫu và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide. Kết quả là protein OmpL1 được biểu hiện chủ yếu nằm ở pha không tan. Do đó, chúng tôi tiến hành biểu hiện protein OmpL1 ở các điều kiện khác nhau về nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu để cải thiện tính tan của protein OmpL1 và thu được lượng protein mt OmpL1 tốt nhất.
Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen OmpL1.
Quá trình tổng hợp protein trong tế bào chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng, các chất dinh dưỡng,... nên việc khảo sát các điều kiện tối ưu cho tổng hợp protein đích là điều quan trọng. Vì vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát nhiệt độ nuôi cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi cảm ứng để thu được protein OmpL1 tốt nhất sử dụng cho tạo kháng khuyên.
3.2.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng protein tái tổ hợp bởi nhiệt độ có thể làm ảnh hưởng đến sự ổn định của plasmid trong tế bào. Nhiệt độ cao gây nguy cơ đào thải plasmid đồng thời có thể làm cho mARN dễ bị phân hủy. Với mục tiêu thu được lượng lớn protein OmpL1 có hoạt tính mà khơng lẫn quá nhiều protein của E. coli, tăng hiệu
quả quá trình tinh sạch protein sau này, khả năng tổng hợp protein tái tổ hợp OmpL1 đã được khả sát ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 28°C, 32°C và 37°C. Việc tối ưu ở dải nhiệt độ dưới 37°C có ý nghĩa lớn mặc dù đây là nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của vi khuẩn E. coli nhưng phần lớn protein OmpL1 thu được lại ở dạng khơng tan, vì vậy, việc tiến hành tối ưu nuôi cấy cảm ứng
ở nhiệt độ thấp giúp thu được các protein tái tổ hợp ở dạng tan, tạo thuận lợi cho việc tinh sạch protein và đánh giá hiệu suất tổng hợp protein OmpL1 ở nhiệt độ thấp. Sau q trình ni cảm ứng, chúng tơi ly tâm thu tế bào và thực hiện kiểm tra mức độ biểu hiện, tính chất của các protein tái tổ hợp được tạo ra. Kết quả điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide có chứa SDS cho thấy, tại hai nhiệt độ 28°C và 37°C mức độ biểu hiện protein OmpL1 của E. coli tương đương nhau và kém hơn nuôi cảm ứng tại 32°C thể hiện với băng nhỏ và mảnh hơn (Hình 3.13). Hơn nữa, cảm ứng ở 32°C sau 5 giờ, tế bào sinh trưởng khá ổn định thể hiện protein tổng số và protein OmpL1 tăng.
Hình 3.13: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau.
1-4: Thời gian cảm ứng lần lượt 28°C, 32°C, 35°C, 37°C.
Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho biểu hiện protein OmpL1 của E. coli là
32°C. Tại nhiệt độ này, tế bào giảm tổng hợp protein nội bào và ưu tiên tổng hợp lượng lớn protein OmpL1.
3.2.2.2. Nồng độ chất cảm ứng IPTG
Protein ngoại lai được điều khiển tổng hợp bởi promoter T7 trên vector pET32a. Promoter này được cảm ứng bởi sự có mặt của IPTG trong mơi tr ởi động q trình sinh tổng hợp protein ngoại lai. Do đó, lượng chất cảm ứng cho vào dịch nuôi cấy cần đảm bảo vừa đủ để trung hòa chất ức chế, qua đó tăng hiệu suất quá trình cảm ứng. Tuy nhiên, nồng độ chất này quá cao có thể gây độc cho tế bào trong khi nồng độ quá thấp dẫn đến tổng hợp kém protein ngoại lai. Như vậy, nồng độ chất cảm ứng ảnh hưởng lớn đến quá trình biểu hiện protein ngoại lai. Đối với hệ biểu hiện pET chứa T7 promoter, hang Novagen khuyến nghị nồng độ IPTG cuối cùng là 0,4 mM. Hơn nữa, đây là loại hóa chất đắt tiền nên việc xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG cần bổ sung ở những nồng độ thấp mà hiệu quả biểu hiện của protein OmpL1 cao sẽ tiết kiệm kính phí. Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tơi tiến hành khảo sát IPTG ở những nồng độ sau: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,4 mM; 0,6 mM ở 32°C và thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng. protein OmpL1 đã biểu hiện ngay ở nồng độ IPTG 0,1 mM và hàm lượng protein OmpL1 có xu hướng tăng dần theo nồng độ IPTG và đạt đỉnh ở nồng độ 0,2 mM. Kết quả điện di kiểm tra protein tổng số của sinh khối trên gel polyacrylamide cho thấy, lượng protein OmpL1 tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất tương ứng với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,4mM (Hình 3.14). Do đó, chúng tôi lựa chọn nồng độ IPTG 0,4 mM cho các bước tiếp theo.ường ni cấy. Khi có mặt IPTG, lac promoter hoạt động và khởi động việc tổng hợp T7 polymerase, chính enzyme này bám vào vị trí T7 promoter để khởi động q trình tổng hợp protein ngoại lai.
Hình 3.14: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau
M: Protein Ladder; 1: Nồng độ IPTG 0.1mM; 2: Nồng độ IPTG 0.2 mM; 3: Nồng độ IPTG 0.3 mM; 4: Nồng độ IPTG 0.4mM
3.2.2.3. Thời gian nuôi cấy cảm ứng
Thời gian cũng là một yếu tố liên quan chặt chẽ đến số lượng và chất lượng protein tái tổ hợp được biểu hiện. Protein tái tổ hợp bắt đầu được biểu hiện ngay sau khi IPTG được bổ sung vào môi trường. Do tế bào chỉ sinh trưởng đến một lượng sinh khối nhất định và dừng lại nên lượng protein tái tổ hợp sẽ đạt đỉnh ở thời điểm này. Chúng tôi tiến hành khảo sát các thời điểm thu mẫu từ 0 giờ đến 5 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,4 mM và nuôi cấy ở 32°C. Kết quả điện di protein tổng số trên gel polyacrylamide cho thấy, băng protein của protein OmpL1 biểu hiện rõ ngay sau 1 giờ cảm ứng và đậm dần sau 4 giờ cảm ứng (Hình 3.15). Cùng với đó, lượng protein tổng số cũng có xu hướng tương tự với protein tái tổ hợp protein OmpL1. Kết quả điện di cũng cho thấy băng protein OmpL1 đậm nhất
ở thời điểm 4 giờ sau khi cho chất cảm ứng, do đó, chúng tôi lựa chọn khoảng thời gian cảm ứng phù hợp nhất cho sự biểu hiện protein OmpL1 là 4 giờ.
Hình 3.15: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác nhau
Sau q trình khảo sát các điều kiện, chúng tơi lựa chọn được các thông số phù hợp nhất cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp protein OmpL1 trong chủng E. coli BL21 là: nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng là 32°C, nồng độ chất cảm ứng là 0,4 mM và thời gian cảm ứng là 4 giờ.
3.2.3. Tinh sạch protein OmpL1
Theo thiết kế của vector biểu hiện pET32a/OmpL1, protein OmpL1 sau khi được tổng hợp sẽ được gắn một đoạn 6 amino acid Histidine ở đầu C, vì vậy protein này có thể dễ dàng tinh sạch bằng cột sắc ký ai lực Ni-Sepharose. Phương pháp tinh sạch bằng cột Ni-Sepharose dựa trên liên kết ái lực giữa ion nickel (Ni2+) với vòng imidazole của Histidine. Khi các amino acid Histidine ở gần nhau thì liên kết giữa chúng với các ion nickel càng mạnh. Protein tái tổ hợp do gen OmpL1 mã hóa có đuôi his-tag với 6 minoacid Histidine liên tục
sẽ liên kết đặc hiệu với ion nickeL. Trong khi đó, các phân tử protein trong tế bào được tổng hợp ra do không có đuôi His - tag sẽ không gắn được với ion niken. Protein tái tổ hợp được giữ lại trên cột sẽ được tách ra khi cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazole thích hợp. Qua khảo sát các điều kiện trong q trình tính chế, protein tái tổ hợp protein OmpL1 được thu lại tốt nhất trong dung dịch đệm có 500 mM imidazole. Trên bản điện di gel SDS-PAGE, protein OmpL1 sau tinh sạch chi có một băng đậm, duy nhất với khối lượng phân tử khoảng 38 kDa đúng với kích thước tính tốn lý thuyết (Hình 3.16). Protein OmpL1 sau khi tinh sạch được thẩm tích loại Imidazole. Chúng tơi đã tinh sạch thành công protein tái tổ hợp OmpL1 với độ tinh sạch khá cao. Như vậy, quy trình tinh sạch qua cột ái lực đối với protein OmpL1 là phù hợp.
Hình 3.16: Điện di đồ sản phẩm sau tinh sạch protein OmpL1 M-Protein Ladder; (1-5) Các phân đoạn thu được sau tinh sạch M-Protein Ladder; (1-5) Các phân đoạn thu được sau tinh sạch
Chúng tôi tiến hành dựng đồ thị chuẩn với BSA có thang chuẩn từ 0 – 2mg. Kết quả đo hấp thụ ở bước sóng 595 nm được trình bày trong bảng 3.2. Từ kết quả đo này, chúng tôi đã xây dựng được đường chuẩn và thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính: y = -0,6404x2 + 2,153x + 0,02 (Hình 3.17)