Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.
Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),... tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.
Tính nồng độ protein:
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595
Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X.
P = X*n
Để tính tốn hàm lượng protein trong 1g mẫu cân: Protein (mg/g) = P x V/m
V = thể tích dung dịch trích ly, ml m = khối lượng mẫu, g
2.2.14. Phương pháp gây miễn dịch trên chuột
Protein thu được sau quá trình sắc ký được tinh sạch để loại bỏ Imidazol bằng phương pháp thẩm tích. Dịch protein được cho vào tui thẩm tích ngâm trong 500ml đệm phosphate đặt trên máy khuấy từ. Thực hiện thẩm tích 3 lần, mỗi lần 12 tiếng. Protein OmpL1 thu được lúc này được coi là đã tinh sạch.
Lựa chọn chuột nhắt trắng từ 5 đến 8 tuần tuổi cho thí nghiệm. Tiêm 250 µg protein OmpL1 tái tổ hợp tinh sạch (pha với 500 µl chất bổ trợ keo phèn) vào chuột thí nhiệm 3 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày và thu huyết thanh bằng phương pháp ly tâm máu ở 4000 vòng/phút tại 4oC vào ngày thứ 21 [44].
2.2.15. Phương pháp Western Blot
Thực hiện Western Blot kiểm tra protein OmpL1 với kháng thể sơ cấp là huyết thanh chuột thí nghiệm và kháng thể thứ cấp là IgG anti-mouse [45]. Mẫu protein cần phân tích được điện di protein trên SDS-PAGE 12,5%. Kết thúc điện di, bản gel được ngâm rửa 15 phút với đệm chuyển màng. Đồng thời, hoạt hóa màng PVDF 30 giây với methanol, rửa với nước cất sau đó ngâm trong đệm chuyển màng ít nhất 10 phút. Fiber pab và giấy thấm được làm ướt bằng đệm chuyển màng 5 phút trước khi tiến hành chuyển màng. Thứ tự chuyển màng như sau : Anode(đỏ)-Trắng-fiber pab-giấy thấm-màng-gel- giấy thấm-fiber pab-đen-Cathode (đen). Đặt bộ chuyển màng vào khay đá lạnh, đổ đệm chuyển màng cho ngập màng. Chuyển màng ở điều kiện 60 mA/gel, 4oC, trong 2 giờ, hiệu điện thế 100V. Sau đó, block màng bằng dung dịc blocking bao gồm TBST có bổ sung 5% skim milk trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (hoặc qua đêm ở 4 oC). Tiếp theo, màng được ủ với kháng thể 1 (huyết thanh chuột thu được theo mục 2.2.11) pha trong dung dich blocking với tỷ lệ 1:50 trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng, rửa màng 3 lần TBST mỗi lần 5 phút. Màng được tiếp tục ủ với kháng thể 2 pha trong dung dịch bloking (tỷ lệ 1:1000) trong 1-2 giờ, rửa màng 3 lần mỗi lần 5 phút. Để hiện film, cần chuẩn bị hỗn hợp 1ml dung dịch A +1 ml dung dịch B ngay trước khi phát hiện kết quả. Phủ màng với dung dịch A+B trong 2-5 phút, thấm khô màng và phủ với màng nilon. Cố định màng vào cassette. Áp phim X-ray lên mang trong 1 thời gian thích hợp (1 hoặc 2…30 phút). Đặt phim lần lượt trong các dung dịch hiện phim, nước rửa và dung dịch cố định phim. Quan sát và phân tích kết quả.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN OmpL1
3.1.1. Tách DNA tổng số của 5 chủng Leptospira interrogans
DNA tổng số là nguồn nguyên liệu rất quan trọng trong các nghiên cứu liên quan đến sinh học phân tử. Từ nguồn nguyên liệu này, các đoạn gen mục tiêu có thể được khuếch đại phục vụ cho các thí nghiệm. Mặc dù hiện nay trình tự DNA của rất nhiều lồi sinh vật đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI, tuy nhiên, đây chỉ là các trình tự mang tính chất tham khảo, phục vụ các đánh giá ban đầu do bộ gen của các sinh vật có khả năng biến đổi sau nhiều thế hệ. Vì vậy, việc sử dụng DNA tổng số làm nguyên liệu cho PCR và giải trình tự là biện pháp chính xác nhất để thu được trình tự của đối tượng nghiên cứu.
Để thu được DNA hệ gen của L. interrogans, vi khuẩn L. interrogans được nuôi lắc trong môi trường LB lỏng ở 37°C qua đêm và tiến hành tách chiết bằng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit theo quy trình tách chiết do nhà sản xuất đưa ra. Bộ kit này sử dụng một màng lọc đặc biệt có khả năng bắt giữ và giải phóng DNA phụ thuộc vào độ pH của mơi trường. Trong q trình tách chiết, DNA được giữ lại trên màng, các thành phần khác được rửa trôi qua màng thông qua li tâm tốc độ cao. Cuối cùng, DNA tổng số được thu hồi bằng dung dịch Elution Buffer cung cấp kèm theo bộ kit và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gen Agarose 1%. Kết quả tách chiết DNA tổng số được trình bày trên Hình 3.1.
Kết quả kiểm tra trên điện di đồ cho thấy DNA là một băng rõ nét, có vệt mờ không đáng kể, có kích thước lớn hơn băng ladder 10kb, đủ điều kiện để làm khuôn nhân gen OmpL1 bằng kỹ thuật PCR.
Hình 3.1: DNA tổng số tách chiết được của 5 chủng Leptospira (1) L. bataviae, (2) L. canicola, (3) L. grippotyphosa, (1) L. bataviae, (2) L. canicola, (3) L. grippotyphosa,
(4) L. icterohaemorrhagiae, (5) L. Pomona
3.1.2. Thu thập, phân tích in-silico và thiết kế cặp mồi đặc hiệu
nhân đoạn OmpL1 của năm chủng Leptospira interrogans
Phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ gen OmpL1 sử dụng các mồi được thiết kế dẫn đến một sản phẩm 963bp. PCR sử dụng cặp mồi này đã phát hiện gen OmpL1 ở tất cả các mẫu thử nghiệm. Sử dụng từ khóa “leptospira
interrogans OmpL1 gen” để tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu của Trung tâm thông
tin Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa kỳ (NCBI) 98 kết quả đã được đưa ra bao gồm trình tự hồn chỉnh, trình tự một phần của gen OmpL1 và trình tự toàn bộ hệ gen của nhiều chủng Leptospira interrogans khác nhau trong đó xuất hiện cả trình tự tham chiếu của năm chủng đang được nghiên cứu. Sau đó trình tự 5 chủng này được lựa chọn và thực hiện gióng hàng với 5 trình tự đã thu được từ các chủng nghiên cứu. Kết quả cho thấy cả năm chủng nghiên cứu tương đồng cao với các trình tự tương ứng đã được công bố trên
Genbank. Như vậy, các chủng giống đã nhận đều chính xác là đối tượng nghiên cứu đã đặt ra.
Trình tự gen OmpL1 tiếp tục được so sánh điểm tương đồng phục vụ việc thiết kế mồi khuếch đại đoạn gen dùng cho tạo protein tái tổ hợp. Kết quả gióng hàng cho thấy có thể chia 5 chủng này thành hai nhóm, nhóm một gồm 3 chủng L. bataviae, L. canicola, L. grippotyphosa có sự tương đồng với nhau lớn, nằm trong khoảng 99%, nhóm hai gồm chủng L. icterohaemorrhagiae và
L. pomona cũng đạt tỷ lệ tương đồng lên đến 98%. Tiến hành so sánh trình tự
nucleotit của 5 chủng xoắn khuẩn (Hình 3.1 & Hình 3.2) kết quả đã tìm ra 77 vị trí khác biệt về trình tự giữa các chủng, trong đó, giữa hai nhóm có độ tương đồng chỉ trên 90%.
Trong đó, giữa 3 chủng L. bataviae, L. canicola, L. grippotyphosa, số lượng vị trí sai khác lần lượt là:
• Chủng L. grippotyphosa có 4 vị trí sai khác với chủng L. bataviae: 132, 144, 507 và 786
• Chủng L. canicola có 8 vị trí sai khác với chủng L. bataviae: 462, 471, 474, 507, 720, 723, 786, 807
• Chủng L. canicola có 8 vị trí sai khác với chủng L. grippotyphosa: 132, 144, 462, 471, 474, 720, 723, 807
• Giữa 2 chủng L. icterohaemorrhagiae và L. pomona, 6 vị trí sai khác lần lượt là: 132, 378, 711, 720, 912, 946
Để đảm bảo protein tái tổ hợp được tạo ra có khả năng tạo đáp ứng miến dịch cho cả 5 chủng Leptospira, đoạn gen OmpL1 dùng để tạo protein tái tổ hợp cần phải đại diện được cho cả 5 chủng vi khuẩn này. Cơng cụ IEDB được sử dụng để dự đốn các vị trí quyết định kháng nguyên nằm trên đoạn gen. Kết quả dự đoán thu được 32 vị trí epitope trên đoạn gen OmpL1 (16 epitop tế bào B và, 16 epitope tế bào T). Kết quả cũng cho thấy cả hai vùng gen chúng tơi lựa chọn đều rất giàu epitope. Trình tự vùng giàu epitop được dự đoán của gen OmpL1 của tế bào lympho B và lympho T thông qua các công cụ cũng cho biết chính xác độ dài, điểm mở đầu và điểm kết thúc của từng đoạn epitope.
Một số kết quả nghiên cứu trong những năm gần đây: sử dụng 8 epitope từ OmpL187-98, OmpL1173-191, LipL4130-48, LipL41233-256 của tế bào lympho B và
OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL41233-256, LipL41263-282 của tế bào lympho T
cho thấy các epitop OmpL1173-191 và LipL41233-256 có ý nghĩa trong sản xuất vacxin chống lại Leptospira .
Năm 2016, Xiao Guohui đã tiến hành nghiên cứu protein tái tổ hợp từ 6 epitop từ tế bào lympho B và T từ các protein màng ngoài trên OmpL1, LipL21 và LipL32 tạo tiền đề cho sự phát triển vacxin phản ứng chéo phổ biến chống lại Leptospirosis. Việc xác định các vùng giàu epitop bằng tin sinh là bước cơ sở, cần tiến hành thực nghiệm để xác định được đoạn gen thích hợp nhất gắn vào vòng plasmid trong nghiên cứu vacxin tái tổ hợp. Từ kết quả phân tích cả 5 trình tự thấy rằng, vùng gen được dự đoán có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cao nhất nằm trong khoảng nucleotide 300 đến 800 (Hình3.3). Do vị trí này có sự khác biệt lớn về trình tự giữa 5 chủng
Leptospira, trình tự amino acid được phân tích để tìm ra đoạn trình tự có thể
sử dụng để đại diện cho 5 chủng này. Trình tự DNA được dịch mã sang trình tự amino acid bằng công cụ BioEdit và sau đó tiếp tục được gióng hàng bằng cơng cụ này.
Từ trình tự amino acid của 5 chủng xoắn khuẩn cho thấy có sự phân chia làm 2 nhóm cụ thể, nhóm thứ nhất là L. bataviae, L. canicola, L. grippotyphosa và nhóm thứ hai là L. icterohaemorrhagiae, L. pomona. Trong 77 vị trí sai khác trong các chủng xoắn khuẩn từ của trình tự nucleotit chỉ dẫn đến sai khác 22 vị trí trên trình tự amino acid.
• Trình tự amino acid ở 3 chủng L. bataviae, L. canicola, L. grippotyphosa là giống nhau hồn tồn.
• Trình tự amino acid ở 2 chủng L. icterohaemorrhagiae, L. pomona là giống nhau hồn tồn.
• Các vị trí sai khác giữa 2 nhóm lần lượt: 54, 55, 62, 63, 70, 73, 75, 79, 88, 101, 112, 155, 214, 218, 222, 228, 233, 234, 273, 291, 316, 317.
• Như vậy, vẫn có sự khác biệt về trình tự amino acid giữa hai nhóm với mức độ tương đồng giữa hai nhóm được tính tốn đạt 93,4%. Nhìn chung,
trình tự amino acid của 5 chủng Leptospira được sử dụng có độ tương đồng
cao trong khoảng vị trí 123 đến 215 tương ứng với đoạn từ vị trí 369 đến 645 trên trình tự DNA (Hình 3.4). Như vậy, đoạn gen sử dụng để tạo protein tái tổ hợp cần nằm trong khoảng này để đảm bảo đại diện cho 5 chủng Leptospira
này. Từ những kết quả đã thu được, đoạn gen từ vị trí 369 đến 645 được lựa
chọn nằm trong vùng khuếch đại của mồi đã thiết kế. Do đoạn đoạn gen này trên cả 5 chủng có độ tương đồng cao, DNA của chủng L. bataviae được lựa chọn làm nguyên liệu cho phản ứng khuếch đại gen OmpL1. Gen nhân bản có thể được sử dụng để biểu hiện và tái tổ hợp OmpL1 như một kháng nguyên hiệu quả và được bảo tồn, và có thể là một ứng cử nhân vắc xin hữu ích chống lại Leptospirosis.[46]
Hình 3.2: Kết quả gióng hàng trình tự chuẩn của 5 chủng Leptospira interrogans
Hình 3.3: Kết quả gióng hàng trình tự chuẩn của 5 chủng Leptospira interrogans (tiếp)
A B
C D
E
Hình 3.4: Kết quả dự đốn vùng quyết định kháng nguyên trên gen OmpL1 của năm chủng Leptospira
(A) L. bataviae, (B.) L. canicola, (C) L. grippotyphosa, (D) L. icterohaemorrhagiae, (E) L. pomona
Hình 3.5: Kết quả gióng hàng trình tự amino acid của năm chủng Leptospira
Sau khi nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen OmpL1, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pET32a và vector nhân dịng pJET1.2/bunt, chúng tơi nhận thấy điểm cắt của enzyme cắt giới hạn XhoI và EcoRV đều có trong
vector pJET1.2 và có trong vùng biểu hiện của vector pET32a. Tuy nhiên,
XhoI khơng có trong trình tự gen OmpL1, do đó chúng tôi đã thiết kế mồi phản ứng PCR có thêm trình tự của enzyme này. Đối với trường hợp enzyme
EcoRV, chúng tơi thấy rằng trình tự enzyme này đã có trong trình tự gen OmpL1 và có thể được sử dụng để thiết kế mồi. Bằng việc sử dụng công cụ
Primer3, cặp mồi khuếch đại đoạn gen đã được thiết kế sử dụng để tạo protein tái tổ hợp OmpL1 (Bảng 3.1)