CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.15. Phương pháp Western Blot
Thực hiện Western Blot kiểm tra protein OmpL1 với kháng thể sơ cấp là huyết thanh chuột thí nghiệm và kháng thể thứ cấp là IgG anti-mouse [45]. Mẫu protein cần phân tích được điện di protein trên SDS-PAGE 12,5%. Kết thúc điện di, bản gel được ngâm rửa 15 phút với đệm chuyển màng. Đồng thời, hoạt hóa màng PVDF 30 giây với methanol, rửa với nước cất sau đó ngâm trong đệm chuyển màng ít nhất 10 phút. Fiber pab và giấy thấm được làm ướt bằng đệm chuyển màng 5 phút trước khi tiến hành chuyển màng. Thứ tự chuyển màng như sau : Anode(đỏ)-Trắng-fiber pab-giấy thấm-màng-gel- giấy thấm-fiber pab-đen-Cathode (đen). Đặt bộ chuyển màng vào khay đá lạnh, đổ đệm chuyển màng cho ngập màng. Chuyển màng ở điều kiện 60 mA/gel, 4oC, trong 2 giờ, hiệu điện thế 100V. Sau đó, block màng bằng dung dịc blocking bao gồm TBST có bổ sung 5% skim milk trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (hoặc qua đêm ở 4 oC). Tiếp theo, màng được ủ với kháng thể 1 (huyết thanh chuột thu được theo mục 2.2.11) pha trong dung dich blocking với tỷ lệ 1:50 trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng, rửa màng 3 lần TBST mỗi lần 5 phút. Màng được tiếp tục ủ với kháng thể 2 pha trong dung dịch bloking (tỷ lệ 1:1000) trong 1-2 giờ, rửa màng 3 lần mỗi lần 5 phút. Để hiện film, cần chuẩn bị hỗn hợp 1ml dung dịch A +1 ml dung dịch B ngay trước khi phát hiện kết quả. Phủ màng với dung dịch A+B trong 2-5 phút, thấm khô màng và phủ với màng nilon. Cố định màng vào cassette. Áp phim X-ray lên mang trong 1 thời gian thích hợp (1 hoặc 2…30 phút). Đặt phim lần lượt trong các dung dịch hiện phim, nước rửa và dung dịch cố định phim. Quan sát và phân tích kết quả.