CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.11. Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)
PAGE)
Để kiểm tra kích thước và độ tinh sạch của protein, dịch tan được điện di trên gel acrylamide theo phương pháp của Laemmli [43]. Hỗn hợp 15µl dịch tan và 5µl SBB được ủ ở 95oC trong 5 phút rồi đặt ngay lên đá. Tiếp theo tiến hành li tâm 13000 vòng/phút, 24oC, 5 phút trước khi bơm vào giếng điện di. Gel Acrylamide chạy điện di gồm 2 lớp: lớp gel tách 12,5% và lớp gel cô 5%, tỷ lệ thành phần như bảng 2.7.
Bảng 2.7: Thành phần gel Acrylamide
Thành phần Gel tách 12,5% Gel cô 5%
Dung dịch acrylamide 30% 2,000 ml 0,40625 ml 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 1,250 ml 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 0,625 ml Nước cất 1,750 ml 1,444 ml APS 10% 0,040 ml 0,040 ml TEMED 0,007 ml 0,010ml
Sử dụng đệm Tris-glycine pH 8,8 chứa SDS 1% và hiệu điện thế 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm. Bản gel điện di được nhuộm với dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn
hợp methanol:axetic:nước với tỉ lệ thể tích là 3:1:6 khoảng 20 phút. Gel được tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.
2.2.12. Phương pháp sắc ký ái lực
Quá trình tinh sạch sử dụng gel Ni-Sepharose, cột và hệ thống sắc ký tự động AKATAprime Plus của GE Healthcare. Đầu tiên, cân bằng cột gel với 5 lần thể tích đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol. Cho dịch tan chảy qua cột với tốc độ 0,6ml/phút. Lần lượt sử dụng đệm phosphate 0,02M có bổ sung và Imidazol 5mM và đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol 60mM để loại bỏ các protein không gắn cột. Phần protein được gắn trên cột được rửa chiết bằng đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol 500mM. Kết quả tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp SDS-PAGE.