2.3.4. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Húng quế
Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan phương pháp thực hiện dựa theo tác giả Tôn Long Dày (2013). Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt,...
Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngồi này có thể phán đốn và đánh giá sơ bộ về chất lượng của tinh dầu và mục đích sử dụng tinh dầu.
60
Màu sắc và độ trong suốt
Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào một ống thủy tinh trong suốt khơng có màu có dung tích 20 ml, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu tinh dầu vẫn cịn đục, khơng trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.
Mùi
Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu, mỗi một loại tinh dầu đều có một một mùi đặc trưng riêng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và mục đích sử dụng của nó.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc hoặc bơi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc,...).
Vị
Vị cũng là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu, mỗi một loại tinh dầu cũng có mùi vị riêng. Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất (ngọt, đắng,…) và cường độ của vị (dịu, thoảng,…).
2.3.4.1. Xác định chỉ số vật lý Định lượng tinh dầu: Định lượng tinh dầu:
Theo (TCVN 8444:2010) hàm lượng tinh dầu được tính theo cơng thức:
% Tinh dầu =số ml tinh dầu thu được sau chưng cất
số g nguyên liệu tươi hoặc héo × 100%
Tỷ trọng tinh dầu húng quế
Tỷ trọng của tinh dầu tại 20ºC là tỷ số khối lượng tinh dầu ở 20ºC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20ºC.
Do hàm lượng tinh dầu thu được ở mỗi lần chưng cất rất thấp, các phương pháp bảo quản chưa được tối ưu dẫn đến việc tinh dầu bị quang hóa, oxy hóa có thể ảnh hưởng đến kết quả đo tỷ trọng. Vì vậy việc sử dụng bình tỷ trọng 10ml khơng phù hợp, thay vào đó tỷ trọng được thực hiện theo phương pháp thủ công.
Dùng ống tiêm y tế (1 ml), trên thân ống tiêm được vạch một đường làm dấu. Cách xác định:
61
– Ban đầu, đem cân ống tiêm không và ghi số liệu lại (m0).
– Tiếp theo: hút nước cất đến vạch (lưu ý trong ống tiêm khơng có bong bóng khí), đem cân và ghi lại số liệu (m1). Rồi xả bỏ nước trong ống tiêm vẩy cho khô nước.
– Cuối cùng: hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý khơng để cho có bong bóng khí trong ống tiêm) đem cân và ghi lại số liệu (m2).
– Theo (TCVN 189:1993), tỷ trọng tinh dầu được tính theo cơng thức sau:
𝐝𝟐𝟎𝟐𝟎 = 𝐦𝟐−𝐦𝟎 𝐦𝟏−𝐦𝟎
Trong đó: m0: khối lượng của ống tiêm khơng, tính bằng
m1: khối lượng của ống tiêm và nước cất, tính bằng gam (g). m2: khối lượng của ống tiêm và tinh dầu, tính bằng gam (g). – Cứ như thế lặp lại nghiệm thức 3 lần: d (tb) = (d1 + d2 + d3)/3
Độ hòa tan của tinh dầu trong ethanol.
– Pha cồn 90º, 80º, 70º từ cồn tuyệt đối.
– Dùng pipette chuẩn hút 1 ml tinh dầu Húng quế cho vào bình tam giác có nút mài. Từ buret nhỏ dần ethanol vào bình đựng tinh dầu. Sau mỗi lần nhỏ khoảng 0,2 ml vào đậy nút, lắc đều cho đến khi tan hết tinh dầu. Tiếp tục nhỏ ethanol vào và lắc cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất trong suốt, ghi lượng ethanol đã dùng.
– Lặp lại thao tác 3 lần.
2.3.4.2. Xác định chỉ số hóa học Chỉ số acid (Index acid) Chỉ số acid (Index acid)
Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hoà các acid tự do trong 1 g tinh dầu, KOH trung hoà các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng:
RCOOH + KOH → RCOOK + H2O
Cách xác định:
– Cho vào erlen 100 ml: 10 ml ethanol, thêm vào 5 giọt dung dịch chỉ thị phenolphthalein. Cho tiếp 1 g tinh dầu (± 0,005 g), lắc đều cho dầu tan hoàn toàn. Tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1N đến khi xuất
62
hiện màu hồng bền trong 30 giây. Ta thực hiện phép đo 3 lần, ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1N (VKOH) dùng chuẩn độ, lấy kết quả trung bình.
– Theo (TCVN 189:1993), chỉ số acid được tính theo cơng thức:
𝐈𝐀 =𝟓, 𝟔𝟏. 𝐕𝐦
Trong đó: VKOH: số ml dung dịch KOH 0,1N dùng chuẩn độ
5,61: số mg KOH có trong 1 ml dung dịch KOH 0,1N m: số g tinh dầu dùng để chuẩn độ
Chỉ số ester (Index Ester)
Chỉ số ester hoá của tinh dầu là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid béo nằm ở dạng ester có trong 1 g tinh dầu.
Cách xác định:
– Dùng burett cho 20 ml dung dịch KOH 0,5N vào erlen để xà phịng hóa có
chứa lượng mẫu đã xác định chỉ số acid ở trên lắp ống sinh hàn ngược vào bình đun cách thủy trong 1 giờ đến khi phản ứng xà phịng hóa kết thúc (lúc đó dung dịch trong bình màu hồng, đồng thời xuất hiện tinh thể nhỏ màu vàng nâu).
– Đồng thời làm một mẫu đối chứng với 20 ml dung dịch KOH 0,5N trong
ethanol và 10 ml ethanol 96º, tiến hành trong cùng điều kiện như trên.
– Đun xong để nguội cho vào 2 erlen mỗi erlen 5 giọt chỉ thị màu phenolphetalein 2%, chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N. Hiệu số giữa số ml dung dịch HCl 0,1N đã dùng trong mẫu đối chứng và số ml dung dịch HCl 0,1N đã dùng trong mẫu thử là số ml HCl đã dùng để trung hòa lượng KOH dùng cho phản ứng este hóa.
– Theo (TCVN 189:1993), chỉ số ester được tính theo cơng thức:
𝐈𝐄 =𝟓, 𝟔𝟏. (𝐕𝟏− 𝐕𝟎) 𝐦
Trong đó: V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml)
V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml) 5,61: số mg KOH có trong 1 ml dung dịch KOH 0,1N m: số g tinh dầu bạch đàn
63
Chỉ số savon hoá (Index Savon)
Chỉ số aavon hoá là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả các acid tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1 g tinh dầu.
Q trình savon hố tinh dầu bao gồm:
– KOH trung hoà các acid tự do: KOH + RCOOH → RCOOK + H2O
– KOH xà phịng hố các ester: KOH + R1COOR2 → R1COOK +R2OH
Theo (TCVN189:1993), chỉ số savon hoá của tinh dầu bằng tổng số giữa chỉ số ester hoá và chỉ số acid:
IS = IE + IA
Trong đó: IS: chỉ số savon hố
IE: chỉ số ester hoá
IA: chỉ số acid hoá
2.3.4.3. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu
Thành phần hoá học của tinh dầu Húng quế được xác định bằng phương pháp sắc kí ghép khối phổ GC/MS với các điều kiện như sau:
– Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS: HP6890
– Cột mao quản: dài 30 m, đường kính trong 250 µm, lớp phim dày 250 µm.
– Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 250ºC – Tỷ lệ dòng (splitless)
– Đầu do khối phổ tứ cụ (MSD)
– Tốc độ dịng khí mang (He) 0,9 ml/phút, áp suất 6,9 psi.
Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu ở 60ºC, giữ trong 4 phút. Sau đó tăng lên 100oC, với tốc độ tăng 10ºC/phút. Tiếp tục tăng đến 280ºC với tốc độ tăng 30ºC/phút và giữ trong 15 phút (Phùng Thị Ái Hữu, 2012).
Phát hiện sự có mặt của các cấu tử có trong tinh dầu Húng quế tại Viện Cơng nghệ Hóa học TP. Hồ Chí Minh (số 01 Mạc Đĩnh Chi, quận 1, TP. Hồ Chí Minh) trên thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ. Việc định danh các thành phần trong tinh dầu được thực hiện bằng cách dùng phần mềm cài đặt sẵn trên máy để so sánh các phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn có trong thư viện phổ.
64
tính bằng đại lượng độ tương thích. Độ tương thích càng cao thì kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hồn tồn giống với phổ khối của một chất chuẩn trong thư viện thì độ tương thích là được biểu thị là 1000. Độ tương thích đạt trên 800 được xem là cho kết quả có độ tin cậy cao.
2.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn
Hình 2.10. Sơ đồ quy trình đánh giá hoạt lực kháng vi sinh vật của tinh dầu Húng quế thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị tinh dầu Húng quế gồm: – 1 mẫu tinh dầu nguyên chất
– 3 mẫu tinh dầu đã được pha loãng ở lần lượt các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3. Chuẩn bị 2 loại vi khuẩn và 1 loại nấm:
– E. coli
Cấy trang
Đặt khoanh giấy tẩm tinh dầu và kháng sinh vào đĩa đã cấy vi sinh vật
Ủ trong tủ ấm ở điều kiện thích hợp cho từng loại vi sinh vật trong 24 giờ
Đo kích thước
vịng kháng vi sinh vật và chụp ảnh Vi khuẩn thuần
Tinh dầu Húng quế, kháng sinh, kháng nấm
Thấm vào giấy lọc với đường kính 6 mm
Pha lỗng Tăng sinh
65
– S. aureus
– A. flavus
Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh (Ampicillin 10 µg) để đối chiếu vi khuẩn và mẫu thuốc kháng nấm (Nystatin 1 mg/1ml) để đối chiếu nấm mốc.
Cân chính xác 100 mg mỗi loại: thuốc kháng sinh Ampicillin và kháng nấm Nystatin cần thử, hịa tan vào 10 ml nước cất, nếu thuốc khơng tan trong nước thì hịa tan với DMSO, ta sẽ được nồng độ dung dịch mẹ 10 mg/ml.
Chuẩn bị môi trường
Thạch nền: sử dụng mơi trường NA, pha NA vào nước cất sau đó hấp khử trùng 121ºC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 50ºC đến 60ºC sau đó đổ vào các đĩa petri đã tiệt trùng. Để nguội sau đó úp ngược đĩa petri lại.
Môi trường lỏng: sử dụng môi trường NB, pha 4 g NB vào 500 ml nước cất sau đó chia ra làm 4 lọ để hấp khử trùng 121ºC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phịng sau đó cấy E.coli vào lọ số (1), S. aureus vào lọ số (2), còn lọ số (3) dùng để set máy. Sau đó mang đi lắc.
Chuẩn bị 20 ống nước muối sinh lý 0,9 % hấp khử trùng 121ºC, 1 atm, 15
phút.
Nguyên tắc
Các hợp chất kháng khuẩn có trong tinh dầu sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu tinh dầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vịng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu bằng đường kính vịng kháng khuẩn và kháng nấm (mm).
Tiến hành
Đối với vi khuẩn
− Lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô
trùng (NaCl 0,9%), lắc đều.
− Dùng micropipette hút 0,1 ml huyền dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa và đạt
mật độ 106 CFU/ml cho vào giữa đĩa môi trường đã được chuẩn bị sẵn.
− Sau đó đặt 3 đĩa giấy có tẩm tinh dầu Húng quế được pha lỗng theo các nồng độ lần lượt là 10-1, 10-2, 10-3 và 1 đĩa giấy kháng sinh (Ampicillin 10 µg) có
66
đường kính 6 mm lần lượt vào các đĩa mơi trường đã được cấy khuẩn.
− Để yên trong vòng 30 phút để tinh dầu và kháng sinh ĐC có thể thẩm thấu
vào đĩa một cách tuyệt đối.
− Lật ngược các đĩa lại và đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại vi khuẩn trong 24 ± 2 giờ ( E. coli: 35 ± 2ºC, S. aureus: 35 ± 2ºC).
− Tiến hành đọc kết quả thơng qua việc đo đường kính vịng ức chế (mm).
Đối với nấm mốc
− Lấy sinh khối nấm mốc hòa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô
trùng (NaCl 0,9%), lắc đều.
− Dùng micropipette hút 0,1 ml dung dịch nấm mốc cho vào giữa đĩa môi trường đã được chuẩn bị sẵn.
− Sau đó đặt 3 đĩa giấy có tẩm tinh dầu Húng quế được pha loãng theo các
nồng độ lần lượt là 10-1, 10-2, 10-3 và kháng nấm (1 mg/ml) có đường kính 6 mm lần lượt vào các đĩa mơi trường đã được cấy nấm.
− Để yên trong vòng 30 phút để tinh dầu và kháng sinh ĐC có thể thẩm thấu
vào đĩa một cách tuyệt đối.
− Lật ngược các đĩa lại và đem ủ trong tủ ấm ở 25 ± 2ºC trong 48 – 72 giờ.
− Tiến hành đọc kết quả thơng qua việc đo đường kính vịng ức chế (mm).
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khếch tán trên đĩa thạch cùa Hadacek và cộng sự (2000). Theo đó, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo bán kính vịng ức chế vi sinh vật (BK) theo cơng thức:
BK = D – d
Trong đó: BK: bán kính vịng ức chế vi sinh vật (mm)
D: đường kính vịng vơ khuẩn (mm)
d: đường kính khoanh giấy kháng (mm) Kháng sinh và kháng nấm ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi sinh vật thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi sinh vật đó đối với kháng sinh và kháng nấm được biểu diễn bằng đường kính các vịng kháng khuẩn và kháng nấm xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
67
2.3.7. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Dùng thước đo vòng kháng khuẩn (mm), kháng nấm (mm) và chụp hình. So sánh đường kính vịng kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu với kháng sinh.
2.3.8. Phương pháp tính tốn
Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mức độ nhạy cảm của vi sinh vật với dịch chiết được phân loại dựa theo đường kính vịng vơ khuẩn của (Celikel và Kavas, 2008):
– Đường kính vịng kháng khuẩn, kháng nấm < 8 mm: khơng nhạy
– Đường kính vịng kháng khuẩn, kháng nấm từ 9 – 14 mm: nhạy
– Đường kính vịng kháng khuẩn, kháng nấm từ 15 – 19 mm: rất nhạy
– Đường kính vịng kháng khuẩn, kháng nấm > 20 mm: cực nhạy
Hình 2.11. Mơ tả kết quả vịng kháng vi sinh vật (Hudzicki, 2009) 2.5. THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm MicroSoft Excel 2016® và phần mềm xử lý số liệu SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các số liệu trung bình có cùng ký tự a, b,... thì khơng có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
68
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH DẦU HÚNG QUẾ THU ĐƯỢC TRONG QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT BẰNG DẦU HÚNG QUẾ THU ĐƯỢC TRONG Q TRÌNH CHƯNG CẤT BẰNG PHƯƠNG PHÁP LƠI CUỐN HƠI NƯỚC
3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế tinh dầu Húng quế
Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu cành, tỷ lệ nguyên liệu/thế tích nước chưng cất là 1/3, nồng độ NaCl 10%, thời gian ngâm nguyên liệu 30 phút, thời gian chưng cất 120 phút. Tiến hành khảo sát kích thước nguyên liệu ở bốn kích thước xay 1 phút, cắt 1 cm, cắt 5 cm và cắt 10 cm. Sau khi trích ly, so sánh lượng tinh dầu thu được để xác định được kích thước nguyên liệu tối ưu nhất.
Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế Nghiệm thức Kích thước Thể tích tinh dầu (ml) Hàm lượng tinh dầu (%) Đánh giá cảm quan
A1 Xay 1 phút 0,30 0,20c Trong suốt, vàng nhạt,
mùi thơm dịu
A2 Cắt 1 cm 0,50 0,33b Trong suốt, vàng nhạt,
mùi thơm dịu
A3 Cắt 5 cm 0,83 0,55a Trong suốt, vàng
nhạt, mùi thơm dịu
A4 Cắt 10 cm 0,57 0,38b Trong suốt, vàng nhạt,
mùi thơm dịu
*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có sự