Aspergillus flavus (A. flavus) thuộc:
Giới (Regnum) : Fungi
Ngành (Division) : Ascomycota
Lớp (Class) : Eurotiomycetes
Bộ (Ordo) : Eurotiales
37
Chi (Genus) : Aspergillus
Loài (Species) : Aspergillus flavus
Tên khoa học là Aspergillus flavus
Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài, có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy lồi. Đường kính của sợi nấm thường từ 3 – 5 µm, có khi 10 µm, thậm chí là 1 mm. Chiều dài sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn, có thể phân nhánh và các nhánh có thể phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm xù xì như bơng. Trên môi trường đặc biệt và trên một số hợp chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.
A. flavus phát triển tốt với hoạt độ nước từ 0,86 và 0,96. Nhiệt độ thích hợp là 30
– 38ºC, tối đa là 44 – 47ºC, độ ẩm tương ứng để bảo từ nảy mầm là 80%, độ ẩm thích hợp sinh sản vơ tính là 86%.
A. flavus là loại nấm thường có mặt trong mơi trường và có thể gây bệnh trên
các loại ngũ cốc tích trữ trong thời gian dài. Nấm có thể nhiễm trên Bắp, Đậu phụng, Bông vải và cây Đậu. Chúng có thể là tác nhân gây bệnh cho người thường là suy giảm miễn dịch hoặc liên quan đến bệnh aspergillosis của phổi, đôi khi gây bệnh trên kết mạc, nấm tai, nhiễm trùng mũi hầu. Sự phá hủy của nấm A. flavus đặc biệt thường hay sinh aflatoxin, có thể gây viêm gan cấp, ung thư gan, gây suy giảm miễn dịch. Bào tử A. flavus là các dị ngun, đơi khi gây bệnh dưới bất kỳ hình thức nào.
1.8. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT VẬT
Hai phương pháp chính dùng để xác định hoạt tính kháng vi sinh vật là phương pháp khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng. (Hadacek và cộng sự, 2000).
1.8.1. Phương pháp đĩa giấy khuếch tán
Thường áp dụng với các chất không thể khuếch tán trong bản thạch. Là phương pháp hay dùng để làm kháng sinh đồ
38
Nguyên tắc: dùng đĩa giấy có tẩm dung dịch chất thử đặt lên mặt thạch đã tráng một lớp huyền dịch vi khuẩn. Chất thử sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế.
Ưu điểm: nhanh, gọn, thực hiện dễ dàng.
Nhược điểm: nếu chất thử không khuếch tán vào bản thạch sẽ cho kết quả sai lệch.
1.8.2. Phương pháp đục lỗ
Nguyên tắc: dùng đĩa thạch được tráng sẵn một lớp huyền dịch vi khuẩn, để khô mặt thạch, đục các lỗ tròn đến đáy hộp. Cho dung dịch thử vào các lỗ, chất thử sẽ khuếch tán vào lớp thạch xung quanh, tạo vùng ức chế quanh chỗ đục lỗ.
Ưu điểm: có thể thực hiện với hầu hết mọi chất.
Nhược điểm: cần thăm dị để tìm ra dung dịch đệm và mơi trường để chất thử nghiệm khuếch tán tốt nhất. Phương pháp này cũng đòi hỏi thời gian và kinh nghiệm. Đối với các phương pháp trên, chất thử được coi là có tính kháng khuẩn nếu có vịng ức chế rõ ràng. Nếu vi khuẩn trên bề mặt thạch mọc yếu hay các chất thử nghiệm có khả năng bay hơi thì cần lặp lại bằng phương pháp pha lỗng.
1.8.3. Phương pháp pha loãng
Phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỏng
Nguyên tắc: trong một dãy các ống nghiệm có chứa mơi trường lỏng đã pha sẵn chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau, dùng pipette vô khuẩn để đưa vi
khuẩn thử nghiệm vào. Đem ủ ở 35 – 37oC trong vịng 16 – 20 giờ. Nếu có tác
dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường lỏng (mơi trường sẽ trong), ngược lại, nếu có sự tăng trưởng của vi khuẩn, môi trường sẽ đục.
Ưu điểm: nhanh gọn, dễ thực hiện.
Nhược điểm: chỉ áp dụng được với các chất dễ tan trong nước.
Phương pháp pha loãng trong thạch
Nguyên tắc: pha lỗng chất thử vào mơi trường thạch đun chảy, đổ vào hộp petri. Chấm huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch, ủ 16 – 24 giờ. Nếu có khóm vi khuẩn mọc lên thì chất thử khơng có tác dụng, nếu vi khuẩn khơng mọc thì chất thử có tác dụng ức chế. Trường hợp vi khuẩn mọc yếu thì cần lặp lại thử nghiệm,
39
kiểm tra các yếu tố có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm (chất nhũ hóa, dung mơi hịa tan, nhiệt độ mơi trường,…).
Ưu điểm: có thể sử dụng cho các chất khó tan, khơng tan trong mơi trường. Nhược điểm: phương pháp này đòi hỏi kinh nghiệm trong việc chấm vi khuẩn lên bản thạch và phương pháp này đòi hỏi số lượng vi khuẩn mỗi lần chấm là như nhau.
1.9. SẮC KÝ GHÉP KHỐI PHỔ VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG (GC–MS/ GAS CHROMATOGRAPHY MASS SPECTOMETRY) CHROMATOGRAPHY MASS SPECTOMETRY)
Sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật GC/MS, các nhà hố học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, kỹ thuật GC/MS ứng dụng rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm,…
1.9.1. Sắc ký khí (GC - Gas Chromatography)
Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động. Trong sắc ký lỏng (LC) pha động là một dung môi hữu cơ, cịn trong GC pha động là một khí trơ gống như helium. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu. Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa q trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động.
Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích thước, kích cỡ rất đa dạng. Cột của GC dài có thể là 25 m, 30 m, 50 m, 100 m và
40
có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tránh bằng một lớp polimer đặc biệt nhưphenyl 5% + dimetylsiloxane polymer 95%, đường kính cột thường rất nhỏ như là một ống mao dẫn. Thông thường cột được sử dụng là semivolatile, hợp chất hữu cơ không phân cực như PAHs, các chất trong hỗn hợp được phân tích bằng cách chạy dọc theo cột này. Một chất chia tách, rửa giải phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dị. Đầu dị có khả năng tạo ra một tín hiệu bất kỳ lúc nào, khi phát hiện ra chất cần phân tích. Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (TR).
Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ từ các tín hiệu. Đây gọi là sắc đồ, mỗi một peak trong sắc đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký và đi vào đầu dị detector, trục hồnh biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu, trong hình mỗi đỉnh (peak) biểu diễn một chất riêng
lẻ, chất này được tách từ hỗn hợp mẫu phân tích, peak có thời gian lưu (TR) 4,97
phút là dodecane; 6,36 phút là biphenyl; 7,64 phút là chlolobiphenyl; 9,41 phút là hexadecanoic acid methyl ester.
Nếu trong cùng điều kiện sắc ký như nhiệt độ, loại cột,… gống nhau thì cùng chất ln có thời gian lưu giống nhau, khi biết thời gian lưu của hợp chất thì chúng ta có thể chấp nhận được độ nhạy của nó. Tuy nhiên, chất có tính chất giống nhau thì thường có thời gian lưu giống nhau.