2.2.9.2. So sánh khả năng sinh trưởng và hình thái của cây chuyển gen giai đoạn vườn ươm
Tiến hành thu thập số liệu và đánh giá sự sai khác giữa cây chuyển gen và cây đối chứng cây thông qua các chỉ tiêu về chiều cao cây và hình thái lá (hình dạng, màu sắc và kích thƣớc lá) ở các thời điểm 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng sau khi cấy vào bầu.
Lá đƣợc chọn để đo kích thƣớc vẫn là các lá ở vị trí thứ 3 - 4 tính từ ngọn của cây ở giai đoạn 3 tháng tuổi. Tổng số lá đo đếm là 180 mẫu lá/ dòng (2 lá/cây), đơn vị đo giai đoạn vƣờn ƣơm là cm.
2.2.10. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số
Các mẫu bạch đàn chuyển gen (mẫu lá đƣợc thu sau khi đƣa ra vƣờn ƣơm từ 1-2 tháng tuổi) đƣợc tách chiết ADN tổng số theo phƣơng pháp CTAB [72] có cải tiến một số bƣớc cụ thể nhƣ sau:
Cân 100 mg mẫu lá sau khi nghiền mịn bằng nitơ lỏng đƣợc đựng trong ống eppendorf 2 ml, bổ sung 700µl đệm chiết (EDTA 0,5M pH8, 100mM Tris HCl pH8, 500mM NaCl, 2% CTAB, 1% PVP và 0,1% β- mecaptoethanol). Ủ hỗn hợp dịch chiết và mẫu ở 55o
C trong vòng 60 phút. Ly tâm 20.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, dùng pipet hút phần dịch sang ống eppendorf 2ml mới và bổ sung 30µl Rnase rồi ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37oC. Tiếp tục bổ sung 700µl Chlorofom: Isoamyalcohol (tỷ lệ thể tích 24:1), lắc đều và ly tâm 20.000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipet hút phần dịch nổi phía trên chuyển sang ống eppendorf 1.5 ml rồi bổ sung thêm Isopropanol (tỷ lệ 1:1,5) và ủ ở -20o
C trong 30 phút. Sau đó đem ly tâm 20.000 vịng/phút trong 10 phút rồi thu tủa ADN. Rửa tủa bằng Ethanol 70o
lạnh kết hợp với ly tâm. Để ADN ở nhiệt độ phịng trong 5 phút rồi hịa tan bằng 100µl đệm 1x TE và bảo quản trong tủ lạnh -20o
C.
Kiểm tra độ sạch trên gel Agarose 0,8% bổ sung 5µl/100ml RedsafeTM
của iNtRON (ww.intronbio.com) và đo nồng độ, độ tinh sạch ADN tổng số trên máy quang phổ hấp phụ nanodrop.
2.2.11. Xác định sự có có mặt của gen trong cây chuyển gen bằng PCR PCR
Để xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong các dòng cây bạch đàn chuyển gen mục tiêu EcHB1, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để nhân gen mục
tiêu từ genome của cây chuyển gen bằng cặp mồi đặc hiệu CaMV 35S-F và EcHB1-R theo phƣơng pháp của Trần Hồ Quang và cộng sự (2015) [70].
Trình tự mồi, thành phần phản ứng PCR và chu trình thực hiện đƣợc trình bày ở Bảng 2.1, Bảng 2.2 và Bảng 2.3.
Các cặp mồi phân lập đƣợc thiết kế dựa trên tham khảo các trình tự trên GenBank. Các cặp mồi phục vụ cho thí nghiệm tạo vector biểu hiện đƣợc thiết kế có thêm các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn thích hợp (Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Tên Trình tự Nhiệt độ gắn Tên Trình tự Nhiệt độ gắn mồi (Tm) CaMV 35S-F 5’ CTTCGCAAGACCCTTCCTC 3’ 55,5 oC EcHB1_R 5’ TTAACAAGCGGCTGATGGATGAGC 3’ 54,6 oC Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ sử dụng Thể tích phản ứng (µl) PCR master mix 2X 12,5 CaMV 35S - F 10 µM 1,0 EcHB1-R 10 µM 1,0 dH2O 7,2 ADN 25 ng 3,2 Tổng thể tích 25 Bảng 2.3. Chu trình phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC)
Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 40 giây
3 Gắn mồi 52 30 giây 35
4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 7 phút 1
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% bổ sung 5 µl/100ml RedsafeTM
của iNtRON (ww.intronbio.com).
2.2.12. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 - 5 lần lặp. Q trình tiến hành thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Bộ môn Sinh học phân tử - Viện NC Giống và CNSH Lâm nghiệp.
Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm trên phƣơng pháp phân tích thống kê toán học đƣợc xử lý bằng ứng dụng Data Analysis trên Excel.
- Trung bình mẫu: I n i X n X 1 1 - Phƣơng sai: S2= 1 1 n Xi X n i ( 1 )2
Dùng hàm thống kê ANOVA để phân tích phƣơng sai một nhân tố với các lần lặp, trong đó giá trị P-valueđƣợc sử dụng để kiểm định giả thuyết H0
(giữa các dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng là khơng có sự sai khác ở giá trị trung bình của các chỉ tiêu theo dõi). Nếu P-value < 0,001 thì giả thuyết H0 bị bác bỏ (với mức độ sai khác 99,9%), ngƣợc lại giả thuyết đƣợc chấp nhận nếu P-value > 0,001.
Các cơng thức tính tốn:
- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo =
- Tỷ lệ chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc =
- Tỷ lệ mẫu sống trên môi trƣờng chọn lọc =
- Chỉ số kích thƣớc lá (I) đƣợc xác định theo cơng thức:
3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. QUY TRÌNH CHUYỀN GEN VÀO CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP THÔNG QUA A. TUMEFACIENS QUA A. TUMEFACIENS
3.1.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin
Thí nghiệm xác định ngƣỡng nồng độ của Km để chọn lọc hiệu quả cây bạch đàn lai UP chuyển gen đƣợc tiến hành bằng việc thử nghiệm các nồng độ Kanamycin từ 0 mg/l đến 150 mg/l cho các đoạn thân đƣợc cắt từ Bạch đàn lai UP chƣa chuyển gen. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1 sau đây. Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin Công thức Km (mg/l) Tỷ lệ mẫu sống sau 2 tuần (%) Tỷ lệ mẫu sống sau 3 tuần (%) Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần (%) ĐC 0 100,0 100,0 100,0 1 10 97,8 86,7 75,6 2 50 86,7 64,4 44,4 3 75 72,2 27,8 13,3 4 100 53,3 16,7 8,9 5 150 18,3 0 0 P-value < 0,001 < 0,001 < 0,001
Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 4 tuần ni cấy Km có ảnh hƣởng trực tiếp tới tỷ lệ sống của đoạn thân. Ở công thức đối chứng các mẫu trên môi trƣờng không bổ sung Km nên mô thực vật vẫn phát triển tốt, sau 4 tuần ni cấy các mẫu có tỷ lệ sống đạt 100%. Cịn trên mơi trƣờng có bổ sung Km các mơ, tế bào bị hố nâu hoặc bạch tạng, không phát triển rồi chết do các mơ tế bào bình thƣờng bị kháng sinh này ức chế làm mất sức sống và khả năng phát
triển. Tỷ lệ sống sót của đoạn thân giảm mạnh từ 75,6% (10 mg/l Km) xuống còn 8,9% (100 mg/l Km). Khi tiếp tục tăng nồng độ Km lên 150 mg/l, không cịn mẫu nào sống đƣợc trên mơi trƣờng này (tất cả các mẫu đều chết từ tuần thứ 3 theo dõi). Căn cứ vào các kết quả trên nồng độ Km là 150 mg/l đƣợc lựa chọn làm cơ sở để chọn lọc các mẫu bạch đàn lai chuyển gen ở các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.1).
Hình 3.1. Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa
chuyển gen
Chú thích: a,c. Chồi chƣa chuyển gen trên môi trƣờng không bổ sung Km;
b,d. Chồi chƣa chuyển gen trên môi trƣờng bổ sung Km
Ngoài ra việc thử nghiệm đánh giá khả năng ra rễ của chồi bạch đàn lai UP không chuyển gen ở những mức nồng độ Km khác nhau cũng đƣợc tiến hành nhằm tìm đƣợc nồng độ chọn lọc Km thích hợp cho chọn lọc cây chuyển gen ở giai đoạn ra rễ. Đối với các dòng bạch đàn lai UP trong giai đoạn tái sinh mô sẹo và phôi soma cũng nhƣ giai đoạn nhân nhanh, chọn lọc chồi thƣờng đƣợc tiến hành ở nồng độ chất chọn lọc Km cao còn giai đoạn ra rễ lại thƣờng ở ngƣỡng nồng độ thấp. Các nồng độ Km khác nhau từ 0 mg/l đến 50 mg/l đƣợc bổ sung vào môi trƣờng ra rễ Bạch đàn lai UP (½ MS + 15 g/l Sucrose + 2 mg/l IBA + 1 mg/l NAA + 7 g/l Agar), thông qua tỷ lệ chồi ra rễ sau 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần từ đó tìm ra đƣợc ngƣỡng nồng độ Kanamycin thích hợp dùng trong giai đoạn chọn lọc ra rễ. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.2 sau đây.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả năng ra rễ Công Công thức Km (mg/l) Tỷ lệ ra rễ sau 1 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 2 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần (%) ĐC 0 11,3 70,0 95,3 1 10 0 0 18,7 2 25 0 0 4,7 3 50 0 0 0 P-value < 0,001 < 0,001 < 0,001
Kết quả cho thấy, việc bổ sung Km vào môi trƣờng ni cấy có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng ra rễ của các chồi bạch đàn không chuyển gen (Pvalue <0,001). Khi nồng độ Kanamycin bổ sung vào mơi trƣờng lên đến 50 mg/l thì chồi in vitro khơng chuyển gen bị ức chế hồn tồn khả năng ra rễ,
trong khi ở cơng thức ĐC (khơng bổ sung Km) thì tỷ lệ ra rễ đạt 95,3%. Ở khoảng nồng độ 10 - 25 mg/l Km bổ sung vào môi trƣờng, khả năng ra rễ của Bạch đàn lai UP bị ức chế rõ rệt, tuy nhiên mức độ ức chế ra rễ ở mỗi nồng độ là khác nhau. Điều dễ nhận thấy đó là sự sụt giảm đáng kể tỷ lệ mẫu cấy ra rễ: ở công thức bổ sung 10 mg/l Km thì tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần chỉ đạt 18,7%. Trên mơi trƣờng bổ sung 25 mg/l Km thì tỷ lệ ra rễ sụt giảm chỉ còn 4,7% sau 3 tuần. Ở môi trƣờng bổ sung 50 mg/l Km thì hầu nhƣ các chồi đều bị ức chế ra rễ, sau 3 tuần khơng có chồi nào có thể ra rễ, mẫu chồi nuôi cấy bị thâm đen và chết. Kết quả này cũng tƣơng tự với các nghiên cứu của Cheng và cộng sự; Tounier và cộng sự [43]. Do vậy, việc sử dụng Kanamycin với nồng độ 50 mg/l để chọn lọc chồi cây Bạch đàn lai UP chuyển gen ở giai đoạn ra rễ là thích hợp.
3.1.2. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến tỷ lệ tạo mô sẹo
Nghiên cứu xác định tuổi vật liệu thích hợp làm thể nhận gen đƣợc tiến hành với 2 loại vật liệu là đoạn thân và mảnh lá của chồi in vitro ở các độ tuổi
khác nhau tính sau mỗi lần cấy chuyển: 10, 15, 20, 25 ngày tuổi. Các thông số khác đƣợc cố định bởi mật độ vi khuẩn là OD600 = 0,5 với thời gian nhiễm
khuẩn là 10 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ. Sau 3 tuần chuyển gen, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc ở mỗi tuổi chồi khác nhau đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo
Tuổi chồi
in vitro
(ngày)
Số lƣợng mẫu (mẫu)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân
(%)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở mảnh lá (%) 10 250 46,4 41,2 15 250 67,2 62,4 20 250 57,2 52,0 25 250 40,4 37,6 P-value < 0,001 < 0,001