CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là lá non hoặc đoạn thân non khơng chứa chồi nách (Hình 2.1) của các dịng Bạch đàn lai UP (UP72, UP99) in vitro đƣợc cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
Hình 2.1. Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng trong chuyển gen
Chú thích: a. vị trí lá và đoạn thân đƣợc sử dụng làm vật liệu; b. đoạn thân và c.
mảnh lá trên môi trƣờng tạo vật liệu nhận gen
2.1.2. Vật liệu di truyền và chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang vector pGWB2 bao gồm
promoter CamV-35S, gen EcHB1 và gen kháng kháng sinh Kanamycin, đƣợc cung cấp bởi Viện nghiên cứu RIKEN (Nhật Bản). Sơ đồ mô phỏng cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 chứa gen EcHB1 đƣợc thể hiện ở Hình 2.2.
Hình 2.2. Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1
Chú thích: RB: trình tự bờ phải của đoạn T-DNA, LB: trình tự bờ trái của
T-DNA, NPT II: gen mã hóa cho neomycin phosphatransferase kháng kanamycin; NOSP: promoter của gen nopaline synthase, NOST: trình tự kết thúc phiên mã của gen nopaline synthase; 35S: promoter của gen CaMV 35S, EcHB1: gen mã hóa tăng chiều dài sợi gỗ, HPT: gen mã hóa cho hygromycin phosphatransferase kháng hygromycin
Cấu trúc vector này đã đƣợc sử dụng để chuyển gen vào bạch đàn lai UU thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tạo đƣợc một số dòng bạch đàn lai UU chuyển gen đƣợc chứng minh sự có mặt của gen bằng phƣơng pháp lai southern blot và phân tích các chỉ tiêu về chất lƣợng gỗ, từ kết quả của đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ “Nghiên cứu tạo giống Bạch
đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 1: 2011-2014)” đã đƣợc
Hội đồng khoa học và công nghệ các cấp đánh giá nghiệm thu vào năm 2015 [70].
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang gen EcHB1 đƣợc giữ bằng cách
nuôi dịch khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng bổ sung 50 mg/l Kanamycin, 50 mg/l Rifamycin, nuôi ở 28o
C trong 24 giờ và cất giữ trong Glycerol ở -80oC.
2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất
Thiết bị: nồi hấp, tủ an toàn sinh học cấp 2, giàn đèn nuôi cấy, tủ định ôn, máy đo pH, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy PCR, máy ly tâm, máy điện di, máy chụp ảnh gel, máy nuôi cấy khuẩn, máy lắc của các hãng Applied Biosystem, Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Horiba, Hettech, Sartorius, Olympus… Ngồi ra cịn có các thiết bị phụ trợ cho nghiên cứu tế bào, sinh học phân tử gồm pipetman, giàn đèn nuôi cây….
Hóa chất:
+ Mơi trƣờng sử dụng để nuôi cấy mô, tế bào cây bạch đàn là môi trƣờng MS cơ bản (Murashige và Skoog 1962) và mơi trƣờng MS* có thay đổi hàm lƣợng một số chất (Bảng 1 và Bảng 2, Phụ lục 1); các chất điều hòa sinh trƣởng: 6-Benzyl Amino Purine (BAP), Indol-3-Butyric Acid (IBA) và 1-Naphthyl Acetic Acid (NAA); các chất kháng sinh nhƣ: Cefotaxim, Kanamycin... đƣợc cung cấp bởi các hãng Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Biobasic (Canada)…
+ Môi trƣờng sử dụng để ni cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm là mơi trƣờng nuôi cấy LB (Luria and Betani) (Bảng 3, Phụ lục1).