(Nguồn: IFTIB)
Tuy nhiên, hệ thống tái sinh này là phƣơng pháp nhân giống thông qua sự phát triển của các chồi nách và các mắt ngủ, nếu chuyển gen vào hệ thống tái sinh này sẽ tạo ra cây bạch đàn chuyển gen thể khảm, tính trạng sẽ biểu hiện không nhƣ mong muốn và gen chuyển khơng duy trì đƣợc sang thế hệ sau. Vì vậy, để phục vụ mục đích cải thiện giống cây bằng phƣơng pháp chuyển gen thì cần thiết phải có một hệ thống tái sinh cây gián tiếp thơng qua giai đoạn tạo mô sẹo, từ mô sẹo mới tái sinh chồi trực tiếp hoặc qua phơi soma. Nhiều lồi bạch đàn có giá trị nhƣ E. nitens, E. globulus, E. grandis, E.
grandis x E. urophylla đã đƣợc tái sinh thành công qua mô sẹo phát sinh chồi
1.2.3.2. Tái sinh in vitro thơng qua sự hình thành callus và phơi soma
Về ngun lý, callus (mơ sẹo) có thể đƣợc tạo ra từ bất kỳ bộ phận nào của cây (organogenesis) nhƣ trụ dƣới lá mầm, đoạn thân (khơng có chồi nách), lá... Các vật liệu này sau khi đƣợc khử trùng và tạo mẫu sạch sẽ đƣợc nuôi cấy trên mơi trƣờng tạo mơ sẹo và kích thích thành phơi soma, những phơi soma này sau đó phát sinh tạo chồi. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng thông dụng nhất trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật.
Cho đến nay, có hai phƣơng thức tạo phôi soma đƣợc thực hiện cho bạch đàn là tạo phôi soma trực tiếp (direct somatic embryogenesis) và tạo phôi soma gián tiếp (indirect somatic embryogenesis).
- Tạo phôi soma trực tiếp: là phôi soma đƣợc phát triển ngay tại vết cắt của vật liệu sau một thời gian ni cấy trên mơi trƣờng có bổ sung các chất điều hịa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA… Phƣơng pháp này có ƣu điểm rút ngắn đƣợc thời gian, bỏ qua giai đoạn tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo. Tuy nhiên phƣơng pháp này có hệ số tạo phơi soma thấp. Pinto và cộng sự (2002) đã quan sát thấy sự hình thành phơi soma trực tiếp trên bề mặt của trụ dƣới lá mầm của Bạch đàn globulus (E. globulus) sau 25 ngày nuôi cấy ở điều kiện tối trên mơi trƣờng MS có bổ sung NAA ở các nồng độ 3, 5, 15 mg/l [21].
- Tạo phôi soma gián tiếp: là các mơ thực vật khác nhau đƣợc biệt hóa thành mơ sẹo và sau đó biệt hóa thành phơi. Hiệu suất tạo phôi soma gián tiếp phụ thuộc vào tuổi của mẫu vật và sự phối hợp nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng. Đối với bạch đàn trắng, hiệu suất tạo phôi soma cao nhất là 61% đƣợc quan sát trên mô sẹo tạo ra từ trụ dƣới lá mầm 10 ngày tuổi với nồng độ BAP là 1 mg/l và NAA là 0,1 mg/l. Còn đối với mẫu 15 ngày tuổi, hiệu suất tạo phơi soma giảm xuống cịn 45% và 19% cho mẫu 25 ngày tuổi. Mẫu 30 ngày tuổi cho hiệu suất tạo phôi soma thấp nhất (10%) [40].
Nghiên cứu về khả năng tái sinh in vitro từ các nguồn vật liệu khác nhau ở bạch đàn đƣợc thực hiện đầu tiên vào năm 1964 bởi Jacquiot cho các loài bạch đàn E. caladocalyx, E. gomphocephala, E. gunnii, E. tereticornis và
tissue). Sau đó một năm, Sussex đã sử dụng trụ dƣới lá mầm (hypocotyl) để tạo mô sẹo và nuôi cấy lỏng tế bào cho Bạch đàn caman (E. camaldulensis) [41].
Xác định khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ các loại vật liệu khác nhau (cụm hoa non, các phần của hoa, phôi hạt, trụ dƣới lá mầm, đoạn chồi) của cây trội Bạch đàn lai grandis (E. grandis hybrid) 5 tuổi đã đƣợc Warrag và cộng sự thực hiện [42]. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự hình thành mơ sẹo (callus) phụ thuộc vào loại mẫu vật, trong đó cụm hoa non có khả năng tạo mô sẹo ở nồng độ đến 10 mg/l 2,4D nhƣng khả năng tái sinh cây từ cụm mô sẹo này không quan sát thấy.
Đối với bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla khả năng tạo mô sẹo từ chồi, đoạn thân và lá của cây trội 3 năm tuổi đƣợc nhân giống in vitro là nhƣ nhau, trong đó mẫu lá cho kết quả trội hơn. Trong các chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc sử dụng thì IBA và NAA khi ở nồng độ 10 mg/l đều cho khả năng tạo mô sẹo, tuy nhiên khi đƣợc bổ sung 2,4D ở nồng độ 1 mg/l thì khả năng tạo mơ sẹo là tốt nhất [43].
Bùi Văn Thắng và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tái sinh cây Bạch đàn uro (E. urophylla) thông qua phôi soma làm cơ sở phục vụ chuyển gen GS1
đã sử dụng thân mần và lá mầm làm vật liệu chuyển gen trong môi trƣờng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng 0,5 mg/l BAP và 0,2 mg/l NAA cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 100% [44].
Bạch đàn lai UU (E. urophylla x E. urophylla) thích hợp tạo mơ sẹo ở nồng độ cao 4 mg/l 2,4D kết hợp với BAP nồng độ 3 mg/l cho hiệu quả mô sẹo cao 87,9% ở thân và 90,5% ở lá; môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin, 0,5 mg/l NAA, 0,1 mg/l IBA cho tỷ lệ cảm ứng phôi soma đạt 62,2% [45].
1.2.3.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo và lai giống chọn tạo và lai giống
Khác với phƣơng pháp lai giống, sử dụng chỉ thị phân tử sẽ giúp cho việc lựa chọn các cặp lai thích hợp với các tính trạng lai có định hƣớng và
nhanh chóng chọn đƣợc con lai có tính trạng mong muốn [46], [47]. Vì vậy trong những năm gần đây các nghiên cứu về phát hiện các chỉ thị phân tử liên kết chặt với một số tính trạng quý của bạch đàn đã phát triển nhanh chóng. Marques và cộng sự (1998) đã nghiên cứu tìm thấy 1 QTLs về hiệu suất bột giấy và 21 QTLs về khả năng nhân giống sinh dƣỡng của các giống bạch đàn lai (E. tereticornis x E. globulus). Các nghiên cứu về bạch đàn E. globulus tại Australia đã tìm thấy 5 gen dự tuyển (candidate gene) liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin [48], 5 QLTs liên quan đến mật độ gỗ, 3 QLTs về hiệu suất bột giấy, 3 QLTs về chiều dài sợi gỗ [49]. Thumman và cộng sự (2005) đã xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa mức độ đa hình của gen mã hóa cho enzyme Cinnamoyl CoA redutase (CCR) - một trong những gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin của bạch đàn E. nitens x E. globulus
AFLP [50], [51]. Việc phát hiện ra các chỉ thị phân tử này giúp chọn lọc giống bạch đàn mới với những tính trạng mong muốn.
Tại Việt Nam đã có một số cơng trình nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn urophylla [52], bạch đàn lai [53], bạch đàn trắng [54] cho kết quả tốt. Qua nghiên cứu, các tác giả đã chọn lọc đƣợc 20 chỉ thị SSR liên quan đến các tính trạng sinh trƣởng ở Bạch đàn lai và 2 chỉ thị tƣơng quan đến tính kháng bệnh trên lá của Bạch đàn caman. Các đề tài đã chọn lọc đƣợc 10 dòng bạch đàn lai sinh trƣởng nhanh, 3 dịng bạch đàn trắng kháng bệnh đốm lá, trong đó dịng bạch đàn lai CU98 và CU82 đã đƣợc công nhận là giống cây trồng lâm nghiệp mới cho phép phổ biến ra sản xuất.
1.2.3.4. Chuyển gen cho loài bạch đàn
Trên thế giới, phƣơng pháp chuyển gen vào bạch đàn phổ biến nhất đƣợc sử dụng là chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [55]. Các phƣơng pháp khác nhƣ chuyển qua xung điện [56], súng bắn gen, siêu âm [57] đƣợc sử dụng nhƣng còn hạn chế.
Đối với bạch đàn, một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin, cellulose, tính chất gỗ đã đƣợc xác định cho các loài Bạch đàn globulus (E. globulus); Bạch đàn gunnii (E. gunnii); Bạch đàn caman (E.
liên quan đến tăng khả năng hấp thụ lân cũng đã đƣợc phân lập từ Bạch đàn caman, trong số 5 gen đƣợc phân lập thì chỉ có 2 gen có khả năng làm tăng độ hấp thụ lân trên cả điều kiện nghèo và giàu lân [62]. Bảy gen mã hóa cho quá trình tổng hợp cellulose (cellulose synthase CesA gen) đã đƣợc phân lập từ Bạch đàn grandis và các gen này đƣợc cho là đóng vai trị quan trọng trong q trình sản xuất cellulose về chất lƣợng cũng nhƣ chiều dài sợi gỗ [63].
Chuyển gen bạch đàn đã đƣợc thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều loài bạch đàn nhƣ Bạch đàn gunnii, Bạch đàn globulus, Bạch đàn caman, Bạch đàn nitens... và chủ yếu tập trung cho các tính trạng về tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm lƣợng lignin, cellulose), chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh và nhiễm mặn) và sâu bệnh hại (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các lồi bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thơng qua vi khuẩn
A. tumefaciens
Loài Gen mục tiêu Tính trạng
E. camaldulensis uidA, nptII Biểu hiện β-glucuronidase
Cry3A, bar Chống chịu sâu ăn lá
C4H, nptII, uidA Giảm hàm lƣợng lignin và cải thiện chất lƣợng gỗ Antisense Ntlim1
(transcription factor),
uidA, nptII, hpt
Tăng hàm lƣợng cellulose
CodA Chống chịu mặn (tới 30%)
E. globulus uidA, nptII Biểu hiện β-glucuronidase trong mô
urophylla Antisense E. gunni
cad, nptII, uidA
Giảm hàm lƣợng lignin
Mt CS Tăng khả năng hấp thụ
Phosphate vô cơ trong đất acid
E. urophylla Ceceropin D Tăng tính chống chịu với bệnh
Pseudomonas solanacearum
lên đến 35%
GS1 Tăng khả năng sinh trƣởng
GA20 Tăng khả năng sinh trƣởng
E. urophylla x E. urophylla
EcHB1 Tăng chiều dài sợi gỗ
E. saligna P5CSF129A, uidA, nptII
Chống chịu lạnh
1.2.4. Gen EcHB1 và ứng dụng trong cải thiện chiều dài sợi gỗ
1.2.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật
Quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp các chất trong thực vật là một q trình phức tạp, có sự tham gia của nhiều phản ứng, sự xúc tác của hàng loạt các enzyme khác nhau và đƣợc điểu kiển bằng nhiều yếu tố phiên mã. Vì thế việc tác động đến các các yếu tố phiên mã có chức năng điểu khiển các bƣớc sinh tổng hợp của quá trình tổng hợp các chất là một hƣớng đi có hiệu quả hơn trong việc điều khiển sự có mặt của một chất về cả số lƣợng và chất lƣợng.
Nhân tố phiên mã (transcription factors) là những protein đƣợc gắn vào điểm đặc biệt của trình tự ADN và kiểm sốt sự phiên mã của gen. Nhân tố phiên mã thực hiện chức năng của mình bằng cách tăng cƣờng hoạt hóa hoặc kìm hãm tốc độ phiên mã của ARN tại vùng bắt đầu phiên mã của gen [64].
Một yếu tố phiên mã thƣờng điều kiển sự biểu hiện của nhiều gen tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp của chất.
Nhân tố phiên mã có vai trị quan trọng trong q trình sinh trƣởng và phát triển của sinh vật vì nó đảm bảo các gen đƣợc biểu hiện trong tế bào vào đúng thời điểm và đúng số lƣợng trong cơ thể sinh vật. Nó có vai trị trong việc bật/tắt sự phiên mã của các gen thích hợp để làm thay đổi quá trình trao đổi chất trong sinh vật, quá trình biệt hóa tế bào... Đã có 53,319 nhân tố phiên mã thuộc 58 nhóm đƣợc tìm thấy ở 49 lồi thực vật, trong đó gồm 9 lồi tảo, 1 lồi rêu, 3 loài cây hạt trần và 35 loài cây hạt kín [65].
Protein HD-Zip là nhân tố phiên mã đặc thù có trong các lồi thực vật. HD-Zip có cấu tạo gồm miền ADN có chức năng liên kết chặt chẽ với motif khóa kéo leucine (leucine zipper motif) trong việc hình thành dimmer. Hai chuỗi polypeptide ở khóa kéo leucine đƣợc giữ với nhau bởi tƣơng tác kỵ nƣớc giữa acid amin leucine và sự lồng vào của 2 vòng xoắn α. Đây là loại homeodomain (miền đồng hình) chỉ có mặt trong thực vật và đƣợc coi là gen HD-Zip có nguồn gốc từ thực vật bằng cách trao đổi giữa một gen exon của miền đồng hình với một chuỗi khóa kéo leucine. Protein HD-Zip bao gồm 4 phân nhóm (từ I đến IV) dựa trên 4 đặc điểm: (1) sự bảo thủ của domain HD- Zip xác định vị trí ADN gắn kết, (2) cấu trúc gen, (3) các motif bảo thủ phụ thêm (additional conserved motif) và (4) chức năng [66].
Mỗi một nhân tố phiên mã kiểm soát sự hoạt động và phát triển của một vùng thực vật đặc biệt. Nhân tố phiên mã ATHB5 thuộc HD-Zip phân nhóm I có chức năng kiểm sốt sự hình thành trụ dƣới lá mầm và kéo dài rễ sơ cấp [67], ATHB2 thuộc HD-Zip phân nhóm II có chức năng kiểm sốt việc kéo dài tế bào liên quan đến chất lƣợng ánh sáng [68], ATHB8 thuộc phân nhóm III có chức năng kiểm sốt sự phát triển của tƣợng tầng trong quá trình biệt hóa tế bào), ATHB10/GLABRA 2 thuộc phân nhóm IV có chức năng kiểm sốt sự biệt hóa các dạng khác nhau của tế bào trichomes trên lá và thân, và tế bào lông rễ [70]. Nhiều nhân tố phiên mã chỉ hoạt động khi có sự thay đổi của điều kiện sống. Nghiên cứu trên cây Arabidopsis cho thấy nhóm nhân tố phiên mã CBF/DREB1 chỉ hoạt động trong điều kiện lạnh, nhân tố phiên mã
CBF4 hoạt động trong điều kiện hạn và các nhân tố phiên mã này hoạt động để thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chống chịu với các stress này [66].
1.2.4.2. Nhân tố phiên mã gen EcHB1
Sonoda và cộng sự khi phân tích biểu hiện của các gen nhân tố phiên mã trong mô gỗ Bạch đàn caman (E. camaldulensis) bằng kỹ thuật microarray và đã phân lập đƣợc 21 gen nhân tố phiên mã liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin và cellulose và các gen này thuộc nhóm HD-Zip phân nhóm II [3].
Gen EcHB1, gen mã hóa nhân tố phiên mã loại II (HD-Zip class II
transcription factor), liên quan đến việc hình thành và phát triển sợi gỗ đã đƣợc phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên bạch đàn caman. Vai trò của gen này đã đƣợc đánh giá thơng qua việc phân tích biểu hiện của gen. Bằng phƣơng pháp phân tích RT-PCR cho thấy gen này biểu hiện ở thân thành thục 5 tuổi (mature stem) và mô rễ (1 tuổi) của Bạch đàn caman. Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở Bạch đàn caman biến nạp gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của các gen chính liên quan đến q trình sinh tổng hợp lignin nhƣ CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm [3]. Điều này cho thấy việc tăng cƣờng hoạt động của gen EcHB1 có ảnh hƣởng đến quá
trình hình thành xylem trong cây. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy sau khi biến nạp thành công gen EcHB1 vào cây thuốc lá, sau 6 tuần sinh trƣởng tại
nhà kính cho thấy chiều dài sợi gỗ của các dòng thuốc lá đƣợc chuyển gen
EcHB1 dài hơn 20% và có sinh trƣởng về chiều cao hơn 50% so với đối
2. CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là lá non hoặc đoạn thân non khơng chứa chồi nách (Hình 2.1) của các dịng Bạch đàn lai UP (UP72, UP99) in vitro đƣợc cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.