A. tumefaciens
3.3.2. Xác định sự có có mặt của gen EcHB1 trong cây bằng PCR
phƣơng pháp PCR
Tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Agarose 0,8% với đối chứng dƣơng là plasmid tách từ vi khuẩn A. tumefaciens có mang
vector chứa gen EcHB1, đối chứng âm là cây đối chứng chƣa chuyển gen
trồng ngoài vƣờn ƣơm. Kết quả cho thấy trong số 40 dòng bạch đàn lai UP giả định chuyển gen có 11 dòng (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24, CG28, CG29, CG32, CG34, CG35, CG38) xuất hiện một băng duy nhất với kích thƣớc khoảng 759bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn gen EcHB1 và promoter CaMV 35S xuất hiện trên đối chứng dƣơng (Hình 3.16), đối chứng âm không chuyển gen thì không hiện băng.
Theo nhƣ kết quả phân tích cho thấy từ 40 dòng bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 đƣợc kiểm tra thì có 11 dòng cho kết quả PCR dƣơng tính với gen
EcHB1 chiếm tỷ lệ 28,9%. Tỷ lệ này tƣơng đƣơng hoặc cao hơn so với các nghiên cứu chuyển gen cho cây lâm nghiệp trƣớc đây nhƣ ở bạch đàn lai UU khi chuyển gen EcHB1 (có 6/19 dòng kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR và có 1 dòng đƣợc khẳng định bằng phƣơng pháp lai Southern Blot) [79]. Hoặc với Xoan ta khi kiểm tra 70 dòng Xoan ta chuyển gen GA20 chỉ có 5 dòng PCR
dƣơng tính với gen GA20 chiếm tỷ lệ 7,14%, từ 50 dòng Xoan ta chuyển gen
chiếm tỷ lệ 6,0% [25]. Tuy nhiên trong nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây
Xoan ta của Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2019), khi tác giả kiểm tra 55 dòng Xoan ta chuyển gen GS1 dƣơng tính với PCR có 21 dòng dƣơng tính với Southern Blot [80].
Các dòng xuất hiện băng trên gel điện di tiếp tục đƣợc kiểm tra lại lần 2 sau đó 1 tháng. Kết quả cho thấy, 11 dòng này vẫn thể hiện kết quả dƣơng tính với gen EcHB1. Nhƣ vậy, bƣớc đầu đề tài đã tạo ra đƣợc 11 dòng bạch
đàn lai UP chuyển gen EcHB1 (Hình 3.17).
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR
Chú thích: (+): Plasmid mang gen EcHB1;(-): dòng bạch đàn lai UP không chuyển gen; mk: DNA marker 1 kb; giếng số 1-13: (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24,
4. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
- Đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 tăng chiều dài sợi gỗ cho Bạch đàn lai UP với các thông số chính sau:
+ Ngƣỡng nồng độ kháng sinh chọn Kanamycin trong môi trƣờng nuôi cấy cho các giai đoạn chuyển gen kích thích tái sinh chồi và nhân nhanh là 150 mg/l, và cho giai đoạn chọn lọc chồi ra rễ là 50 mg/l.
+ Vật liệu chuyển gen phù hợp là đoạn thân và mảnh lá cây in vitro sau 15 ngày tuổi không chứa chồi và mắt ngủ đƣợc tiền nuôi cấy 48 giờ.
+ Mật độ vi khuẩn OD600=0,5 với thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens là 10 phút là thích hợp nhất cho quá trình biến nạp gen.
+ Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp là 72 giờ.
- Từ quy trình trên đã chọn tạo đƣợc 40 dòng bạch đàn lai UP giả định chuyển gen EcHB1 qua các môi trƣờng chọn lọc, trong đó 11 dòng cho kết
quả dƣơng tính với gen EcHB1 bằng phƣơng pháp PCR (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24, CG28, CG29, CG32, CG34, CG35, CG38) ở giai đoạn vƣờn ƣơm.
4.2. Kiến nghị
Để khẳng định sự có mặt của gen và kiểm tra số lƣợng copy của gen, xác định khả năng biểu hiện của gen đích EcHB1 cần tiến hành thêm các
phƣơng pháp chỉ thị phân tử nhƣ lai Southern blot và RT-PCR.
Ngoài ra, bạch đàn có nhịp điệu sinh trƣởng ổn định từ sau 3 tuổi. Từ giai đoạn đó trở đi, các chỉ tiêu về sinh trƣởng, tính chất gỗ mới phản ánh đúng đặc điểm di truyền của cây. Do vậy, cần tiếp tục theo dõi, đánh giá các dòng bạch đàn chuyển gen và tiến hành phân tích chiều dài sợi gỗ ở độ tuổi cây.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Girijashankar V., 2011, Genetic transformation of eucalyptus.
Physiology and Molecular Biology of Plants, 17, pp. 9-23.
2. Kawasu T., Susuki Y., Wada T., Kondo K., Koyama H., 2003, Over expression of a plant mitochondrial citrate synthase in eucalyptus trees improved growth when cultured by alphosphate as a sole phosphate source, Plant Cell Physiol, 44, pp. 91.
3. Sonoda T., Koita H., Nakamoto Ohta S., Kondo K., Suezaki T., Kato T., Ishizaki Y., Nagai K., Lida N., Sato S., Umezawa T., Hibino T., 2009, Increasing fiber length and growth in transgenic tobacco plants overexpressing a gene encoding the Eucalyptus camaldulensis HD-Zip class II transcription factor, Plant Biotechnology, 26, pp. 115-120.
4. James C., 2019, Global status of commercialized Biotech/GM crops: 2019, ISAAA Briefs 55.
5. Nguyễn Văn Đồng, 2012, Tạo dòng ngô biến đổi gen kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ, Kỷ yếu hội thảo Khoa học Quốc gia – Kết quả nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.
6. Trần Thị Cúc Hòa, Nguyễn Trần Hải Bằng, Trần Đức Cƣơng, 2013, Nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tƣơng chuyển gen kháng ruồi đục thân và sâu đục quả, Hội thảo Quốc gia về Khoa học cây trồng lần thứ
nhất, tr. 441-449.
7. Đặng Thị Vân, 2012, Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong tạo giống kháng bệnh virus xoắn vàng lá cà chua của Việt Nam, Kỷ yếu
hội thảo Khoa học Quốc gia – Kết quả nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.
8. Lê Văn Sơn, 2012, Nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá và xoăn đọt bằng kỹ thuật chuyển gen, Kỷ yếu hội thảo Khoa học Quốc
trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.
9. Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2012, Chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020 – Tình hình thực hiện giai đoạn 2007-2012 và định hƣớng giai đoạn tiếp theo, Kỷ yếu hội thảo Khoa học Quốc gia – Kết quả nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.
10.Trịnh Đình Đạt, 2009, Công nghệ di truyền, tập 4, NXB Giáo dục, Hà
Nội.
11.Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và
ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
12.Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006, Công nghệ sinh
học, tập 2, NXB Giáo dục, Hà Nội.
13.Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai C.J., Chiang V.L., 1999, Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature Biotechnology, 17, pp. 808-812.
14.Li J., Brunner A.M., Meilan R., Strauss S.H., 2009, Stability of transgenes in trees: expression of two reporter genes in poplar over three field seasons, Tree Physiology, 29, pp. 299-312.
15.Wang Y., 2012, Coiled-coil networking shapes cell molecular machinery, Mol Biol Cell, 23(19), pp. 3911-3922
16.Zhang J., Ali Movahedi, Ming Sang, Zhiheng Wei, Junjie Xu, Xiaoli Wang, Xiaolong Wu, Menyang Wang, Tongming Yin, Qiang Zhuge, 2017, Functional analyses of NDPK2 in Populus trichocarpa and
overexpression of PtNDPK2 enhances growth and tolerance to abiotic stresses in transgenic poplar, Plant Physiology and Biochemistry, 117(4), pp. 61-74
17. Waditee R., Nazmul H. Bhuiyan, Vandna Rai, Kenji Aoki, Yoshito Tanaka, Takashi Hibino, Shigetoshi Suzuki, Jun Takano, Andres T. Jagendorf, Tetsuko Takabe, and Teruhiro Takabe, 2005, Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abiotic- stress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis, PNAS February 1, 102 (5), pp. 1318-1323.
18. Yu H.C., Kenichi K., Haga M., 2010, Perilla: The Genus Perilla, Taylor
& Francis, pp. 206.
19.Kawaoka A., Matsunaga E., Endo S., Kondo S., Yoshida K., Shinmyo A., Ebinuma H., 2003, Ectopic expression of a horseradish peroxidase enhances growth rate and increases oxidative stress resistance in hybrid aspen, Plant Physiology, 132, pp. 1177-1185.
20. Jing Z. P., Gallardo F., Pascual M. B., Sampalo R., Romero J., Torres de Navarra A., Canovas D. M., 2004, Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase, New Phytologist, 164, pp. 137-145.
21. Pinto G. P., Santos C. S., Neves L. N., Araujo C. A., 2002, Somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus globulus Labill,
Plant Cell Reports, 21, pp. 208-213.
22.Trần Hồ Quang, 2020, Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ ở Việt Nam, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực
hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực lâm nghiệp, tr. 87-
99.
23. Vƣơng Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cƣờng, Lê Thị Huyền Thanh, Phan Thị Mỵ Lan, Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, 2011, Nghiên cứu ứng dụng
công nghệ gen để tạo cây thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm, Báo cáo tổng kết đề tài 150 trang.
24. Bùi Văn Thắng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, 2013, Nghiên cứu tạo cây Xoan ta (Melia azedarach L.) chuyển gen P5CSm tăng cƣờng khă năng chống chịu khô hạn, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 1, tr.
203- 208.
Nghiên cứu chuyển gien dinh trƣởng nhanh (GA20) và tăng chất lƣợng gỗ (4CL1) vào cây Xoan ta (Melia Azedarach L.). Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, tháng 6/2015, tr. 53-61.
26.Nguyễn Văn Phong, 2020, Nghiên cứu chọn tạo và đánh giá các dòng xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh có triển vọng, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực lâm nghiệp, tr. 100-106.
27.Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Thị Huyền, Chu Hoàng Hà, 2017, Tạo cây Bạch đàn Urô chuyển gen GS1 mã hóa glutamine synthetase tăng cƣờng hiệu quả sử dụng nitrogen, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, số tháng 9/2017.
28.Trần Hồ Quang, 2015, Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến dổi gen cho chiều dài sợi gỗ ở Việt Nam (giai đoạn 1). Báo cáo tổng kết đề tài
thuộc chƣơng trình CNSH trong nông nghiệp và phát triển nông thôn. 29.Eldridge K., Davidson C., Harwood C., Van Wyk G., 1994, Eucalyptus
domestication and breeding, New York: Oxford University Press. 30.GIT Forestry, 2008, Cultivated Eucalyptus global map.
31.Tạp chí Gỗ Việt, 2019, Một năm nhìn lại xu hƣớng năm 2019, http://goviet.org.vn/bai-viet/mot-nam-nhin-lai-va-xu-huong-nam-2019- 8943.
32. Hà Huy Thịnh, Phí Hồng Hải, Nguyễn Đức Kiên, 2011, Chọn tạo giống
và nhân giống cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu, Nhà xuất bản
Nông nghiệp, Hà Nội.
33.Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Việt Cƣờng, 2005, Cải thiện giống Bạch đàn cho các chƣơng trình trồng rừng ở Việt Nam Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 20 năm đổi mới, 5, tr. 167-178.
34. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và
ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
35. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Lƣơng Thị Hoan, Lê Trần Bình, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, 2003, Nhân giống một số loại cây trồng rừng có
năng suất, chất lƣợng cao bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, Hội nghị công
nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr. 910 – 914.
36.Nguyễn Văn Uyển, 1992, Công nghệ sinh học trong cải thiện giống cây
trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
37.Nguyễn Văn Uyển, 1993, Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác
giống cây rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
38.Ho C.K., Chang S.H., Tsay J.Y., Tsai C.J., Chiang V.L., Chen Z.Z, , 1998, Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of
Eucalyptus camal dulensis and production of transgenic plant, Plant Cell, 17, pp. 675 – 680.
39.Harcourt R., Kyozuka J., Floyd R., Bateman K., Tanaka H., Decroocq V., Llewellyn D., Zhu X., Peacock W., Dennis E., 2000, Insect-and herbicide-resistant transgenic eucalypts, Molecular Breeding, 6, pp. 307- 315.
40. Prakash M. G., Gurumurthi K., 2010, Effects of type of explant and age, plant growth regulators and medium strength on somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus camaldulensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 100, pp. 13-20.
41.Sussex I. M., 1965, The origin and morphogenesis of Eucalyptus cell populations, Proceedings of the International Conference on Plant Tissue Culture, pp. 383-391.
42.Warrag E., Lesley M.S., Rockwood D.J, 1991, Nodule culture and regeneration of Eucalyptus grandis hybrids, Plant Cell Reports, pp. 586- 589.
43.Cheng Z., Tsay J., Chung J., 1996, Callus culture of Eucalyptus grandis x urophylla and preliminary studies on organogenesis and Agrobacterium mediated transformation, Taiwan Journal of Forest Sciences, 11(1), pp. 43-52.
44.Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Ngô Văn Thanh, Chu Hoàng Hà, 2014, Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây Bạch đàn uro (Eucalyptus
urophylla) thông qua phôi soma phục vụ chuyển gen, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, số tháng 11/2014.
45.Ngô Thị Minh Duyên, Đỗ Thị Thu, Trần Hồ Quang, 2014, Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây bạch đàn lai uro (Eucalyptus urophylla) thông qua phôi soma từ cây trội đƣợc tuyển chọn phục vụ chuyển gen, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, số 4/2014, tr. 3516-3523.
46.Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997, Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp,
NXB Nông nghiệp quốc gia, Hà Nội.
47.Lê Trần Bình, Lê Thị Muôi, 1999, Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học quốc gia, Hà Nội.
48.Thamarus K.A., Groom K., Murrell J., Byrne M., Moran G.F., 2002, A genetic linkage map for Eucalyptus globulus with candidate loci for
wood, fibre, and floral traits, Theor Appl Genet, 104(3), pp. 379-387. 49.Moran G.F., Karen A., Thamarus, Raymond A. A., Qiu D., Uren T.,
Southerton S. G., 2002, Genomics of Eucalyptus wood traits, 59, pp. 645-650.
50.Thumma B.R., Nolan M.F., Evans R., Moran G.F., 2005, Polymorphisms in Cinnamoyl CoA Reductase (CCR) are associated with variation in microfibril angle in Eucalyptus spp, Genetics 171(3), pp. 1257-1265.
51.Eugenia B., Staden C., Lezar S., 2009, A microarray based method for the parallel analysis of genotypes and expression profiles of wood forming tissues in Eucalyptus grandis, BMC Biotechnol 9, pp. 51.
52.Trần Hồ Quang, Trần Thanh Trăng, 2010, Kết quả nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học và
Công nghệ Lâm nghiệp với phát triển rừng bền vững và biến đổi khí hậu,
tr: 31 – 37.
53.Nguyễn Việt Cƣờng, Nguyễn Việt Tùng, Nguyễn Thị Kim Liên, 2013, Nghiên cứu khả năng ứng dụng chỉ thị SSR trong đánh giá sinh trƣởng các dòng bạch đàn lai, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, 2, tr. 2695-2702.
54.Trần Thanh Trăng, 2020, Chọn tạo giống bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) kháng bệnh đốm lá (cryptosporiopsis eucaluptus) bằng chỉ thị phân tử, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực hiện chương trình
Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Lâm nghiệp, tr. 40-48.
55.Mullins K.V., Llewellyn D.J., Hartney V.J., Strauss., Dennis E.S., 1997, Regeneration and transformation of Eucaluptus camaldulensis, Plant Cell Report, 16, pp. 787-791.
56.Teulieres C., Marque C., Boude A.M., 1994, Genetic transformation of
Eucaluptus, Biotechnology in agriculture and forestry V, plant protoplasts and genetic engineering, 29, pp. 289-307
57.Tournier V., Grat S., Marque C., Kayyal W., Penchel R., Andrade D.G., Boudet A.M., Teulieres C., 2003, An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree (Eucalyptus
grandis x Eucalyptus urophylla), Trans Res, 12, pp. 403-411.
58.Vƣơng Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cƣờng, Lê Thị Huyền Thanh, Phan Thị Mỵ Lan, Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, 2011, Nghiên cứu ứng dụng
công nghệ gen để tạo cây thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm, Báo cáo tổng kết đề tài 150 trang.
59.Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos Thevenot P., Grima Pettenati J., 2002, The vascular expression pattern directed by the
Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is
conserved among woody and herbaceous plant species, Plant Molecular Biology, 50, pp. 497-509.
60.Ho C.K., Chen Y.C., Chen Z.Z., 2002, cDNA cloning and sequence analysis of 5-hydroxyconiferaldehyde O-methyltransferase from
Eucalyptus camaldulensis, Taiwan Journal of Forest Science, 17, pp.
429-438.
61.Ranik M., Myburg A.A., 2006, Six new cellulose synthase genes from