Tuổi chồi
in vitro
(ngày)
Số lƣợng mẫu (mẫu)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân
(%)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở mảnh lá (%) 10 250 46,4 41,2 15 250 67,2 62,4 20 250 57,2 52,0 25 250 40,4 37,6 P-value < 0,001 < 0,001
Kết quả thu đƣợc cho thấy, đoạn thân của chồi in vitro có tuổi khác nhau đều cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao hơn so với mảnh lá, tƣơng ứng với mỗi độ tuổi khác nhau thì cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc sau chuyển gen là khác nhau. Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân và mảnh lá đều tăng dần từ chồi in vitro 10 ngày tuổi lên 15 ngày tuổi rồi lại giảm dần xuống.
Kết quả phân tích cho thấy tuổi vật liệu có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng tạo mô sẹo (Pvalue<0,001). Đối với vật liệu là mảnh lá tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc dao động trong khoảng 40,4% - 67,2% đối với đoạn thân, từ 37,6% đến 62,4% đối với mảnh lá và đạt giá trị cao nhất với vật liệu ở 15 ngày tuổi (67,2% và 62,4% tƣơng ứng cho đoạn thân và mảnh lá) (Bảng 3.3, Hình 3.2). Sau 20 ngày tuổi, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo giảm chỉ còn 40,4% cho đoạn thân và 37,6% cho mảnh lá (Bảng 3.3). Nhƣ vậy vật liệu nuôi cấu mô ở 15 ngày tuổi là tốt nhất để làm vật liệu nhận gen.
Kết quả sử dụng trụ dƣới lá mầm với các ngày tuổi khác nhau để tạo phôi soma ở Bạch đàn caman cho thấy tuổi vật liệu càng cao thì tỷ lệ tạo mơ sẹo càng thấp. Cụ thể, trụ dƣới lá mầm 10 ngày tuổi cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 66,33%, sau đó tỷ lệ này giảm dần xuống còn 44,36%, 27,67% và 11,67% cho mẫu có độ tuổi là 15, 25 và 30 ngày (theo thứ tự tƣơng ứng) [40].
3.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
Thời gian tiền nuôi cấy là khoảng thời gian mà mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng tái sinh trƣớc khi tiến hành quá trình lây nhiễm vi khuẩn. Trong thời gian này, nhờ vết cắt ở mẫu mà các tế bào và mơ của chúng tiến hành q trình phân chia mạnh mẽ. Sau thời gian tiền nuôi cấy thực hiện chuyển gen sẽ giúp vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng xâm nhập thông qua các tế bào, mô đang phân chia.
Đoạn thân và mảnh lá đƣợc cắt từ chồi in vitro từ 3-5 mm đƣợc đặt trên đĩa petri chứa môi trƣờng tiền nuôi cấy [71]. Chúng đƣợc nuôi cấy cảm ứng trong các thời gian: 0, 24, 48, 72 giờ trƣớc khi thực hiện biến nạp gen. Kết
quả ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen đƣợc thống kê sau 3 tuần chuyển gen thông qua tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trình bày trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ
mẫu tạo mô sẹo
Công thức Thời gian tiền nuôi cấy (giờ) Số lƣợng mẫu (mẫu) Đoạn thân Mảnh lá Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) ĐC 0 150 47,3 41,3 46,0 36,7 1 24 150 57,3 52,7 52,7 40,0 2 48 150 68,7 64,7 64,7 43,3 3 72 150 50,0 44,7 47,3 33,3 P-value < 0,001 < 0,001
Thời gian tiền ni cấy có ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn thông qua tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (Pvalue<0,001) (Bảng 3.3). Ở công thức đối chứng (ĐC - không thông qua tiền nuôi cấy) cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp nhất trong các cơng thức thí nghiệm, chỉ đạt 41,5 % với đoạn thân và 36,7% đối với mảnh lá. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tăng dần khi tăng thời gian tiền nuôi cấy từ 24 lên đến 48 giờ, cụ thể tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân dao động từ 41,5% - 64,7% và 36,7% - 43,3% ở mảnh lá. Khi thời gian tiền nuôi cấy đạt 48 giờ rồi cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất (64,7% ở đoạn thân và 43,3% ở mảnh lá). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian tiền ni cấy lên 72 giờ thì tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở cả 2 nguồn vật liệu đều giảm xuống (chỉ còn 44,7% ở thân và 33,3% ở lá). Bởi lẽ, khi tăng thời gian tiền nuôi cấy lên qua cao khiến mẫu
biến nạp sẽ có xu hƣớng phát sinh mơ sẹo tại vị trí có vết cắt dẫn đến giảm hiệu quả chuyển gen do vi khuẩn A. tumefaciens khó xâm nhập qua vết
thƣơng của mẫu.
Vì vậy, qua Bảng 3.4 ta có thể thấy rằng thời gian tiền ni cấy có ảnh hƣởng đến khả năng tiếp nhận gen, thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất là 48 giờ trƣớc khi mẫu đƣợc đem biến nạp gen EcHB1. Kết quả này cũng tƣơng tự đối với loài bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla [73], và bạch đàn E. urophylla với tỷ lệ mẫu thân mầm biểu hiện tạm thời gen gus là 41,6%, tỷ lệ mẫu lá mầm biểu hiện tạm thời gen gus là 47,4% [74].
Hình 3.3. Mẫu bật chồi sau chuyển gen khi tiền nuôi cấy 48 giờ
3.1.4. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bởi giá trị quang phổ OD ở bƣớc sóng 600nm của dịch lỏng vi khuẩn, có liên quan tới sinh khối tế bào của chúng hay số lƣợng tế bào trong một thể tích nhất định. Giai đoạn vi khuẩn sinh trƣởng tốt, phát triển mạnh có ý nghĩa quan trọng để hiệu quả chuyển gen đƣợc cao nhất. Thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen đƣợc thử nghiệm ở các mức đo mật độ vi khuẩn OD600 ngƣỡng 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7. Các thông số khác vẫn đƣợc giữ nguyên (thời gian nhiễm khuẩn là 10 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ).