CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP
1.2.3.2. Tái sinh in vitro thông qua sự hình thành callus và phôi soma
Về nguyên lý, callus (mô sẹo) có thể đƣợc tạo ra từ bất kỳ bộ phận nào của cây (organogenesis) nhƣ trụ dƣới lá mầm, đoạn thân (không có chồi nách), lá... Các vật liệu này sau khi đƣợc khử trùng và tạo mẫu sạch sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo và kích thích thành phôi soma, những phôi soma này sau đó phát sinh tạo chồi. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng thông dụng nhất trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật.
Cho đến nay, có hai phƣơng thức tạo phôi soma đƣợc thực hiện cho bạch đàn là tạo phôi soma trực tiếp (direct somatic embryogenesis) và tạo phôi soma gián tiếp (indirect somatic embryogenesis).
- Tạo phôi soma trực tiếp: là phôi soma đƣợc phát triển ngay tại vết cắt của vật liệu sau một thời gian nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA… Phƣơng pháp này có ƣu điểm rút ngắn đƣợc thời gian, bỏ qua giai đoạn tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo. Tuy nhiên phƣơng pháp này có hệ số tạo phôi soma thấp. Pinto và cộng sự (2002) đã quan sát thấy sự hình thành phôi soma trực tiếp trên bề mặt của trụ dƣới lá mầm của Bạch đàn globulus (E. globulus) sau 25 ngày nuôi cấy ở điều kiện tối trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA ở các nồng độ 3, 5, 15 mg/l [21].
- Tạo phôi soma gián tiếp: là các mô thực vật khác nhau đƣợc biệt hóa thành mô sẹo và sau đó biệt hóa thành phôi. Hiệu suất tạo phôi soma gián tiếp phụ thuộc vào tuổi của mẫu vật và sự phối hợp nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng. Đối với bạch đàn trắng, hiệu suất tạo phôi soma cao nhất là 61% đƣợc quan sát trên mô sẹo tạo ra từ trụ dƣới lá mầm 10 ngày tuổi với nồng độ BAP là 1 mg/l và NAA là 0,1 mg/l. Còn đối với mẫu 15 ngày tuổi, hiệu suất tạo phôi soma giảm xuống còn 45% và 19% cho mẫu 25 ngày tuổi. Mẫu 30 ngày tuổi cho hiệu suất tạo phôi soma thấp nhất (10%) [40].
Nghiên cứu về khả năng tái sinh in vitro từ các nguồn vật liệu khác nhau ở bạch đàn đƣợc thực hiện đầu tiên vào năm 1964 bởi Jacquiot cho các loài bạch đàn E. caladocalyx, E. gomphocephala, E. gunnii, E. tereticornis và
tissue). Sau đó một năm, Sussex đã sử dụng trụ dƣới lá mầm (hypocotyl) để tạo mô sẹo và nuôi cấy lỏng tế bào cho Bạch đàn caman (E. camaldulensis) [41].
Xác định khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ các loại vật liệu khác nhau (cụm hoa non, các phần của hoa, phôi hạt, trụ dƣới lá mầm, đoạn chồi) của cây trội Bạch đàn lai grandis (E. grandis hybrid) 5 tuổi đã đƣợc Warrag và cộng sự thực hiện [42]. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự hình thành mô sẹo (callus) phụ thuộc vào loại mẫu vật, trong đó cụm hoa non có khả năng tạo mô sẹo ở nồng độ đến 10 mg/l 2,4D nhƣng khả năng tái sinh cây từ cụm mô sẹo này không quan sát thấy.
Đối với bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla khả năng tạo mô sẹo từ chồi, đoạn thân và lá của cây trội 3 năm tuổi đƣợc nhân giống in vitro là nhƣ nhau, trong đó mẫu lá cho kết quả trội hơn. Trong các chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc sử dụng thì IBA và NAA khi ở nồng độ 10 mg/l đều cho khả năng tạo mô sẹo, tuy nhiên khi đƣợc bổ sung 2,4D ở nồng độ 1 mg/l thì khả năng tạo mô sẹo là tốt nhất [43].
Bùi Văn Thắng và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tái sinh cây Bạch đàn uro (E. urophylla) thông qua phôi soma làm cơ sở phục vụ chuyển gen GS1
đã sử dụng thân mần và lá mầm làm vật liệu chuyển gen trong môi trƣờng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng 0,5 mg/l BAP và 0,2 mg/l NAA cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 100% [44].
Bạch đàn lai UU (E. urophylla x E. urophylla) thích hợp tạo mô sẹo ở nồng độ cao 4 mg/l 2,4D kết hợp với BAP nồng độ 3 mg/l cho hiệu quả mô sẹo cao 87,9% ở thân và 90,5% ở lá; môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin, 0,5 mg/l NAA, 0,1 mg/l IBA cho tỷ lệ cảm ứng phôi soma đạt 62,2% [45].