A. tumefaciens
3.1.9. Đánh giá khả năng ra rễ và kiểm tra chồi chuyển gen
Các chồi sau biến nạp gen, phát triển đƣợc trên môi trƣờng tái sinh chồi có chứa chất chọn lọc Kanamycin 150 mg/l và có chiều cao chồi thu đƣợc đạt từ 2 - 2,5 cm đƣợc tách thành từng chồi đơn lẻ và cấy chuyển sang môi trƣờng ra rễ (½ MS + 2 mg/l IBA + 1 mg/l NAA + 15 g/l Sucrose + 7 g/l Agar) có bổ sung 50 mg/l Km. Với mẫu đối chứng (ĐC) là những chồi chƣa đƣợc chuyển gen), sau 2 lần cấy chuyển trên môi trƣờng ra rễ (mỗi lần chọn lọc cách nhau 3 tuần), các chồi ra rễ và sinh trƣởng tốt sẽ đƣợc nhân lên, quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.9 sau đây.
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc Vật liệu Số lần chọn lọc Số lƣợng (chồi) Số chồi ra rễ (chồi) Tỷ lệ chồi ra rễ sau mỗi lần chọn lọc (%) ĐC Chọn lọc lần 1 60 0 0 Chọn lọc lần 2 0 0 0 Đoạn thân Chọn lọc lần 1 66 39 59,1 Chọn lọc lần 2 39 23 34,8 Mảnh lá Chọn lọc lần 1 60 35 58,3 Chọn lọc lần 2 35 17 28,3
Số chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh và sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng ra rễ chọn lọc lần 1 chứa Km 50 mg/l thu đƣợc 74 chồi ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc trên tổng số 186 chồi (60 chồi đối chứng, 66 chồi tái sinh từ đoạn thân và 60 chồi tái sinh từ mảnh lá), tƣơng ứng với 59,1% ở đoạn thân 58,3% từ mảnh lá. Trên môi trƣờng ra rễ chọn lọc lần 2 (Km 50 mg/l) thu đƣợc 39 chồi ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc, tỷ lệ chồi ra rễ của đoạn thân là 34,8% và 17 chồi (chiếm 28,3%) ở vật liệu mảnh lá. Phần còn lại không ra rễ, sinh trƣởng chậm hoặc ngừng sinh trƣởng, trong khi đối chứng (chồi không chuyển gen) 100% chồi không ra rễ, héo dần và chết.
3.2. PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÌNH THÁI CỦA CÁC DÒNG BẠCH ĐÀN LAI CHUYỂN GEN
3.2.1. So sánh hình thái cây Bạch đàn lai UP chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn in vitro chứng giai đoạn in vitro
Trong giai đoạn nuôi cấy in vitro, quá trình đánh giá các chỉ tiêu màu sắc thân, lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng là không có sự khác biệt. Nhƣng các chỉ tiêu về hình thái và chất lƣợng chồi (số lóng trung bình, chiều dài lóng và chiều cao chồi) ở cây chuyển gen có sự khác biệt rõ rệt so với cây đối chứng ở cả 2 dòng nghiên cứu (Bảng 3.10, Hình 3.9). Tuy nhiên, giữa các dòng chuyển gen lại không có sự sai khác về các chỉ số đánh giá này (P - value > 0,001).
Do sự khác biệt về cả chỉ tiêu số lóng trung bình và chiều dài lóng trung bình nên có thể dễ dàng thấy rằng chiều cao chồi của cây chuyển gen và cây đối chứng có sự khác biệt rõ rệt. Chiều cao chồi trung bình ở cây chuyển gen đạt từ 31,2 đến 31,8 cm cao hơn so với cây đối chứng (chỉ đạt từ 28,4 đến 29,2 cm). Kết quả này cũng tƣơng tự với cây Dƣơng P. nigra khi các chồi ở
cây chuyển gen PnEXPA3 có chiều dài hơn so với cây đối chứng [76].
Bảng 3.10. So sánh hình thái thân giữa cây chuyển gen với cây đối chứng
Dòng Tổng số
mẫu
Các chỉ tiêu hình thái thân Số lóng trung bình (số lóng/thân) Chiều dài lóng trung bình (mm) Chiều cao chồi (mm) UP72 90 3,4 ± 0,1 9 ± 0,1 28 ± 0,1 UP72CG 90 3,7 ± 0,1 11 ± 0,1 32 ± 0,1 UP99 90 3,2 ± 0,1 8,5 ± 0,1 29,2 ± 0,1 UP99CG 90 3,65 ± 0,1 10,3 ± 0,1 31,2 ± 0,1 P-value < 0,001 < 0,001 < 0,001
Tuy nhiên, ở một nghiên cứu khác, gen PtrEXPA3 và PnEXPA3 lại
không làm thay đổi về chiều cao chồi ở cây Dƣơng P. tremular chuyển gen
khi đƣợc nuôi cấy ở một điều kiện lạnh (100
C) [77]. Nhƣ vây, hình thái và chiều dài chồi trong nuôi cấy in vitro không những phụ thuộc vào bản chất di truyền mà còn phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng nuôi cấy.
Không những khác biệt rõ rệt về các chỉ tiêu hình thái và chất lƣợng chồi, cây chuyển gen và cây đối chứng cũng có sự sai khác về kích thƣớc của lá: chiều dài và chiều rộng (P-value < 0,001) (Bảng 3.11, Hình 3.9). Kết quả phân tích cho thấy, lá ở cây chuyển gen có kích thƣớc lớn hơn cả về chiều rộng và chiều dài so với lá ở cây đối chứng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây trên một số loài cây Dƣơng và thuốc lá khi các tác giả khẳng định các gen đƣợc chuyển vào cây có ảnh hƣởng rõ rệt đến kích thƣớc của lá ngoại trừ một số trƣờng hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đặc biệt [16], [77]. Tuy nhiên, giữa cây chuyển gen và cây đối chứng lại không có sự sai khác về chỉ số lá khi mà cả 2 đối tƣợng trên đều có giá trị chỉ số lá xấp xỉ 0,51.
Bảng 3.11. So sánh hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng
Dòng Tổng số mẫu Các chỉ tiêu hình thái lá Chiều dài lá (mm) Chiều rộng lá (mm) Chỉ số lá UP72 180 6,3 ± 0,6 3,2 ± 0,1 0,51 UP72CG 180 9,9 ± 0,2 5,1 ± 0,1 0,52 UP99 180 6,8 ± 0,1 3,5 ± 0,1 0,51 UP99CG 180 9,7 ± 0,2 4,9 ± 0,2 0,51 P-value <0,001 <0,001 >0,001
Giữa các dòng giả định chuyển gen UP72CG và UP99CG không có sự sai khác rõ rệt về các chỉ tiêu hình thái và kích thƣớc lá nghiên cứu (P-value > 0,001). Nhƣ vậy, có thể nhận định gen EcHB1 không chỉ có tác dụng trong việc tác động đến chỉ tiêu chiều dài thân mà ảnh hƣởng đến chiều dài và rộng
của lá của cây bạch đàn lai chuyển gen trong giai đoạn in vitro.
Hình 3.9. Hình thái thân và lá của dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng
3.2.2. So sánh hình thái cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn vƣờn ƣơm vƣờn ƣơm
Chồi bạch đàn sau khi ra rễ, đƣợc huấn luyện cho quen với điều kiện tự nhiên rồi đƣợc cấy vào bầu đất và đƣợc theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây và hình thái lá sau 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng tuổi. Kết quả về đánh giá sinh trƣởng chiều cao đƣợc trình bày ở Bảng 3.12 và Hình 3.10.
Kết quả phân tích cho thấy, ở giai đoạn 1 tháng tuổi, chiều cao của cây chuyển gen và cây đối chứng hầu nhƣ không có sự khác biệt đáng kể do giai đoạn đầu các cây chủ yếu tập trung thích nghi với điều kiện tự nhiên ngoài vƣờn ƣơm (P-value > 0,001). Sau 2 tháng tuổi, các dòng cây chuyển gen có sự phát triển mạnh về chiều cao và vƣợt hơn hẳn so với các cây đối chứng (P- value < 0,001). Lúc này chiều cao cây chuyển gen đạt trung bình 6,4 cm gấp 1,3 lần so với chiều cao của cây đối chứng (xấp xỉ 5 cm). Đến giai đoạn 3 tháng tuổi các dòng bạch đàn chuyển gen vẫn có sinh trƣởng về chiều cao hơn hẳn so với cây đối chứng trong cùng 1 điều kiện môi trƣờng.
Bảng 3.12. Đánh giá sinh trƣởng về chiều cao của cây con ngoài vƣờn ƣơm sau 1, 2 và 3 tháng Mẫu Tổng số cây Chiều cao(cm) 1 tháng 2 tháng 3 tháng UP72 90 3,0 ± 0,1 5,1 ± 0,3 16,9 ± 0,9 UP72CG 90 3,1 ± 0,2 6,3 ± 0,5 20,8 ± 0,7 UP99 90 3,1 ± 0,7 4,9 ± 0,6 16,4 ± 1,3 UP99 CG 90 3,2 ± 0,1 6,5 ±0,4 20,7 ± 0,8 P-value > 0,001 < 0,001 < 0,001
Ở cả 3 giai đoạn đo đếm, hầu nhƣ không có sự khác biệt giữa các dòng chuyển gen là UP72CG và UP99CG về chiều cao cây (P-value > 0,001). Điều này chứng tỏ, các dòng chuyển gen là khá tƣơng đồng về sinh trƣởng cũng nhƣ các chỉ tiêu hình thái.
Đối với hình thái lá, dòng bạch đàn lai chuyển gen có dạng bản lá tròn và có kích thƣớc lớn hơn rõ rệt so với lá của cây đối chứng ở giai đoạn 2 tháng tuổi (P-value < 0,001) (Bảng 3.13, Hình 3.11). Tuy nhiên giữa chúng lại không có sự khác biệt về chỉ số lá (P-value > 0,001).
Bảng 3.13. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 2 tháng tuổi
Mẫu Tổng số lá Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) Chỉ số lá UP72 180 3,2 ± 0,1 1,5 ± 0,2 0,47 UP72CG 180 5,0 ± 0,1 2,4 ± 0,3 0,48 UP99 180 3,1 ± 0,3 1,5 ± 0,1 0,48 UP99CG 180 4,8 ± 0,1 2,3 ± 0,1 0,48 P-value < 0,001 < 0,001 > 0,001
Hình 3.11. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai
đoạn 2 tháng tuổi
Đến giai đoạn 3 tháng tuổi, kết quả phân tích thống kê cho thấy các chỉ tiêu chiều dài, chiều rộng lá của các dòng chuyển gen có sự khác biệt so với dòng đối chứng (P-value > 0,001) (Bảng 3.14, Hình 3.12) cụ thể nhƣ sau:
- Về chiều dài lá: giá trị trung bình của các dòng chuyển gen đạt từ 7,5 - 7,6 cm, trong khi các dòng đối chứng có giá trị trung bình từ 4,7 - 4,9 cm.
- Về chiều rộng lá: giá trị trung bình của các dòng chuyển gen đạt trong khoảng 3,7 - 3,8 cm trong khi ở các dòng đối chứng chỉ đạt 2,3 – 2,4 cm.
Tuy nhiên, khi phân tích chỉ tiêu chỉ số lá cho thấy tƣơng tự nhƣ trong điều kiện nuôi cấy in vitro và giai đoạn 2 tháng tuổi, ở giai đoạn 3 tháng tuổi, cây chuyển gen và cây đối chứng không có sự sai khác về mặt thống kê ở chỉ tiêu này (P-value > 0,001) (Bảng 3.14). Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ đối với một số nghiên cứu về đánh giá sai khác về hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen ở một loài cây mô hình nhƣ Arabidopsis thaliana cũng nhƣ trên một số loài cây rừng nhƣ Dƣơng [77], bạch đàn và
thông P. sylvestris [78].
Bảng 3.14. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 3 tháng tuổi
Mẫu Tổng số lá Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) Chỉ số lá UP72 180 4,9 ± 0,2 2,4 ± 0,3 0,49 UP72CG 180 7,6 ± 0,1 3,8 ± 0,1 0,50 UP99 180 4,7 ± 0,2 2,3 ± 0,1 0,49 UP99CG 180 7,5 ± 0,2 3,7 ± 0,1 0,49 P-value < 0,001 < 0,001 > 0,001
Tuy vậy, do hình thái lá là một tính trạng có tính biến dị lớn cá thể, thay đổi theo từng cá thể trong quần thể, nên chỉ số này cũng không ổn định.
Do đó, rất khó đánh giá cây nào thuộc nhóm nào, vì vậy cần sử dụng thêm các chỉ tiêu khác để đƣa ra kết luận chính xác là cây thuộc nhóm chuyển gen hay không chuyển gen. Sự khác biệt về hình thái và kích thƣớc lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng ở bạch đàn lai có thể do ảnh hƣởng của gen EcHB1 là gen liên quan đến phát triển chiều dài sợi gỗ. Tuy nhiên đây mới chỉ là những quan sát và đánh giá bƣớc đầu với số lƣợng các dòng chuyển gen còn hạn chế. Do đó, để đƣa ra đƣợc các kết luận chính xác hơn, cần tiếp tục theo dõi và đánh giá cây chuyển gen và đối chứng khi đƣợc trồng trong điều kiện tự nhiên cũng nhƣ tăng số lƣợng các dòng chuyển gen trong các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.12. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai
đoạn 3 tháng tuổi
3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MANG GEN CỦA CÁC DÒNG BẠCH ĐÀN TẠO ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR
3.3.1. Tách chiết DNA tổng số
Cây con bạch đàn lai chuyển gen và cây đối chứng sau khi cấy vào bầu đất đƣợc chăm sóc trong điều kiện vƣờn ƣơm (Hình 3.13 và 3.14) để bƣớc đầu đánh giá khả năng mang gen EcHB1 bằng Phƣơng pháp PCR. Sau 2-3
tháng, tiến hành thu mẫu lá của cây bạch đàn chuyển gen để tách ADN tổng số theo phƣơng pháp CTAB [73] có cải tiến một số bƣớc, nhằm phục vụ cho
việc xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong cây chuyển gen bằng phƣơng
pháp PCR.
Hình 3.13. Bạch đàn chuyển gen ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc và cây con tại
vƣờn ƣơm
Hình 3.14. Cây con chuyển gen EcHB1 trồng tại vƣờn ƣơm
Kết quả tách ADN đƣợc chạy điện di trên gel Agarose 0,8% với đối chứng dƣơng là λADN, các băng ADN hiện sáng, gọn, có nồng độ và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn khi đo bằng máy nanodrop (Hình 3.15).
Hình 3.15. Kết quả chạy điện di kiểm tra ADN một số dòng Bạch đàn lai UP
3.3.2. Xác định sự có có mặt của gen EcHB1 trong cây bằng phƣơng pháp PCR phƣơng pháp PCR
Tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Agarose 0,8% với đối chứng dƣơng là plasmid tách từ vi khuẩn A. tumefaciens có mang
vector chứa gen EcHB1, đối chứng âm là cây đối chứng chƣa chuyển gen
trồng ngoài vƣờn ƣơm. Kết quả cho thấy trong số 40 dòng bạch đàn lai UP giả định chuyển gen có 11 dòng (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24, CG28, CG29, CG32, CG34, CG35, CG38) xuất hiện một băng duy nhất với kích thƣớc khoảng 759bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn gen EcHB1 và promoter CaMV 35S xuất hiện trên đối chứng dƣơng (Hình 3.16), đối chứng âm không chuyển gen thì không hiện băng.
Theo nhƣ kết quả phân tích cho thấy từ 40 dòng bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 đƣợc kiểm tra thì có 11 dòng cho kết quả PCR dƣơng tính với gen
EcHB1 chiếm tỷ lệ 28,9%. Tỷ lệ này tƣơng đƣơng hoặc cao hơn so với các nghiên cứu chuyển gen cho cây lâm nghiệp trƣớc đây nhƣ ở bạch đàn lai UU khi chuyển gen EcHB1 (có 6/19 dòng kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR và có 1 dòng đƣợc khẳng định bằng phƣơng pháp lai Southern Blot) [79]. Hoặc với Xoan ta khi kiểm tra 70 dòng Xoan ta chuyển gen GA20 chỉ có 5 dòng PCR
dƣơng tính với gen GA20 chiếm tỷ lệ 7,14%, từ 50 dòng Xoan ta chuyển gen
chiếm tỷ lệ 6,0% [25]. Tuy nhiên trong nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây
Xoan ta của Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2019), khi tác giả kiểm tra 55 dòng Xoan ta chuyển gen GS1 dƣơng tính với PCR có 21 dòng dƣơng tính với Southern Blot [80].
Các dòng xuất hiện băng trên gel điện di tiếp tục đƣợc kiểm tra lại lần 2 sau đó 1 tháng. Kết quả cho thấy, 11 dòng này vẫn thể hiện kết quả dƣơng tính với gen EcHB1. Nhƣ vậy, bƣớc đầu đề tài đã tạo ra đƣợc 11 dòng bạch
đàn lai UP chuyển gen EcHB1 (Hình 3.17).
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR
Chú thích: (+): Plasmid mang gen EcHB1;(-): dòng bạch đàn lai UP không chuyển gen; mk: DNA marker 1 kb; giếng số 1-13: (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24,
4. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
- Đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 tăng chiều dài sợi gỗ cho Bạch đàn lai UP với các thông số chính sau:
+ Ngƣỡng nồng độ kháng sinh chọn Kanamycin trong môi trƣờng nuôi cấy cho các giai đoạn chuyển gen kích thích tái sinh chồi và nhân nhanh là 150 mg/l, và cho giai đoạn chọn lọc chồi ra rễ là 50 mg/l.
+ Vật liệu chuyển gen phù hợp là đoạn thân và mảnh lá cây in vitro sau 15 ngày tuổi không chứa chồi và mắt ngủ đƣợc tiền nuôi cấy 48 giờ.
+ Mật độ vi khuẩn OD600=0,5 với thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens là 10 phút là thích hợp nhất cho quá trình biến nạp gen.
+ Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp là 72 giờ.
- Từ quy trình trên đã chọn tạo đƣợc 40 dòng bạch đàn lai UP giả định chuyển gen EcHB1 qua các môi trƣờng chọn lọc, trong đó 11 dòng cho kết
quả dƣơng tính với gen EcHB1 bằng phƣơng pháp PCR (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24, CG28, CG29, CG32, CG34, CG35, CG38) ở giai đoạn vƣờn ƣơm.
4.2. Kiến nghị
Để khẳng định sự có mặt của gen và kiểm tra số lƣợng copy của gen, xác định khả năng biểu hiện của gen đích EcHB1 cần tiến hành thêm các