CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6. Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô
vật liệu khác nhau.
2.2.4. Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
Đoạn thân đƣợc cắt thành những đoạn dài 3 - 5 mm. Mảnh lá có giữ lại cuống đƣợc ni cấy trên môi trƣờng tiền nuôi cấy: MS* + 20 g/l sucrose + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 100 ml/l nƣớc dừa + 2,6 g/l Phytagel + 100 µM AS với các cơng thức thời gian tiền ni cấy là 0, 24, 48, 72 giờ trƣớc khi chuyển gen [71].
Sau đấy thu thập và xử lý số liệu sau 2 tuần chuyển gen để xác định ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy và thời gian phù hợp nhất đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trƣớc khi biến nạp gen.
2.2.5. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pGWB2/EcHB1 sau khi đƣợc cất giữ trong Glycerol ở -80oC cấy trải trên lên đĩa môi trƣờng LB đặc bổ sung 50 mg/l Kanamycin, 50 mg/l Rifamycin, nuôi ở 28o
C trong 2 ngày. Chọn một khuẩn lạc cho vào 2 ml môi trƣờng LB lỏng bổ sung 50 mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifamycin. Ni lắc 200 vịng/phút, ở 28oC, trong 14 - 16 giờ. Sau đó hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng bổ sung 50 mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifamycin, nuôi trong 4 - 5 giờ. Dịch vi khuẩn đƣợc ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000 vòng/phút, trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn trong mơi trƣờng ½ MS lỏng (Phụ lục 1, Bảng 3).
Pha lỗng cho tới khi dịch có OD600 tại các ngƣỡng 0,1; 0,3; 0,5; 0,7
khi đo bằng máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 600nm để tiến hành nghiên cứu sự ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn và xác định mật độ tế bào vi khuẩn tốt nhất biến nạp gen đến tỷ lệ chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc sau 3 tuần tiến hành chuyển gen.
2.2.6. Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo mẫu tạo mô sẹo
Mẫu sau xử lý, chuẩn bị cho biến nạp đƣợc ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn với các khoảng thời gian: 0, 5, 10, 15, 20 phút. Sau đó
thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng. Chuyển mẫu sang môi trƣờng đồng nuôi cấy. Môi trƣờng đồng nuôi cấy đƣợc bổ sung thêm Acetosyringone (AS) với nồng độ 100 µM. Theo dõi khả năng nhiễm khuẩn và tỷ lệ sống của các mẫu nuôi cấy sau 2 tuần biến nạp gen.