CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. QUY TRÌNH CHUYỀN GEN VÀO CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP THÔNG
QUA A. TUMEFACIENS
3.1.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin
Thí nghiệm xác định ngƣỡng nồng độ của Km để chọn lọc hiệu quả cây bạch đàn lai UP chuyển gen đƣợc tiến hành bằng việc thử nghiệm các nồng độ Kanamycin từ 0 mg/l đến 150 mg/l cho các đoạn thân đƣợc cắt từ Bạch đàn lai UP chƣa chuyển gen. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1 sau đây. Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin Công thức Km (mg/l) Tỷ lệ mẫu sống sau 2 tuần (%) Tỷ lệ mẫu sống sau 3 tuần (%) Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần (%) ĐC 0 100,0 100,0 100,0 1 10 97,8 86,7 75,6 2 50 86,7 64,4 44,4 3 75 72,2 27,8 13,3 4 100 53,3 16,7 8,9 5 150 18,3 0 0 P-value < 0,001 < 0,001 < 0,001
Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 4 tuần ni cấy Km có ảnh hƣởng trực tiếp tới tỷ lệ sống của đoạn thân. Ở công thức đối chứng các mẫu trên môi trƣờng không bổ sung Km nên mô thực vật vẫn phát triển tốt, sau 4 tuần nuôi cấy các mẫu có tỷ lệ sống đạt 100%. Cịn trên mơi trƣờng có bổ sung Km các mơ, tế bào bị hố nâu hoặc bạch tạng, không phát triển rồi chết do các mơ tế bào bình thƣờng bị kháng sinh này ức chế làm mất sức sống và khả năng phát
triển. Tỷ lệ sống sót của đoạn thân giảm mạnh từ 75,6% (10 mg/l Km) xuống còn 8,9% (100 mg/l Km). Khi tiếp tục tăng nồng độ Km lên 150 mg/l, khơng cịn mẫu nào sống đƣợc trên môi trƣờng này (tất cả các mẫu đều chết từ tuần thứ 3 theo dõi). Căn cứ vào các kết quả trên nồng độ Km là 150 mg/l đƣợc lựa chọn làm cơ sở để chọn lọc các mẫu bạch đàn lai chuyển gen ở các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.1).
Hình 3.1. Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa
chuyển gen
Chú thích: a,c. Chồi chƣa chuyển gen trên mơi trƣờng khơng bổ sung Km;
b,d. Chồi chƣa chuyển gen trên mơi trƣờng bổ sung Km
Ngồi ra việc thử nghiệm đánh giá khả năng ra rễ của chồi bạch đàn lai UP không chuyển gen ở những mức nồng độ Km khác nhau cũng đƣợc tiến hành nhằm tìm đƣợc nồng độ chọn lọc Km thích hợp cho chọn lọc cây chuyển gen ở giai đoạn ra rễ. Đối với các dòng bạch đàn lai UP trong giai đoạn tái sinh mô sẹo và phôi soma cũng nhƣ giai đoạn nhân nhanh, chọn lọc chồi thƣờng đƣợc tiến hành ở nồng độ chất chọn lọc Km cao còn giai đoạn ra rễ lại thƣờng ở ngƣỡng nồng độ thấp. Các nồng độ Km khác nhau từ 0 mg/l đến 50 mg/l đƣợc bổ sung vào môi trƣờng ra rễ Bạch đàn lai UP (½ MS + 15 g/l Sucrose + 2 mg/l IBA + 1 mg/l NAA + 7 g/l Agar), thông qua tỷ lệ chồi ra rễ sau 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần từ đó tìm ra đƣợc ngƣỡng nồng độ Kanamycin thích hợp dùng trong giai đoạn chọn lọc ra rễ. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.2 sau đây.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả năng ra rễ Công Công thức Km (mg/l) Tỷ lệ ra rễ sau 1 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 2 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần (%) ĐC 0 11,3 70,0 95,3 1 10 0 0 18,7 2 25 0 0 4,7 3 50 0 0 0 P-value < 0,001 < 0,001 < 0,001
Kết quả cho thấy, việc bổ sung Km vào môi trƣờng ni cấy có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng ra rễ của các chồi bạch đàn không chuyển gen (Pvalue <0,001). Khi nồng độ Kanamycin bổ sung vào môi trƣờng lên đến 50 mg/l thì chồi in vitro khơng chuyển gen bị ức chế hồn toàn khả năng ra rễ,
trong khi ở cơng thức ĐC (khơng bổ sung Km) thì tỷ lệ ra rễ đạt 95,3%. Ở khoảng nồng độ 10 - 25 mg/l Km bổ sung vào môi trƣờng, khả năng ra rễ của Bạch đàn lai UP bị ức chế rõ rệt, tuy nhiên mức độ ức chế ra rễ ở mỗi nồng độ là khác nhau. Điều dễ nhận thấy đó là sự sụt giảm đáng kể tỷ lệ mẫu cấy ra rễ: ở công thức bổ sung 10 mg/l Km thì tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần chỉ đạt 18,7%. Trên mơi trƣờng bổ sung 25 mg/l Km thì tỷ lệ ra rễ sụt giảm chỉ cịn 4,7% sau 3 tuần. Ở mơi trƣờng bổ sung 50 mg/l Km thì hầu nhƣ các chồi đều bị ức chế ra rễ, sau 3 tuần khơng có chồi nào có thể ra rễ, mẫu chồi ni cấy bị thâm đen và chết. Kết quả này cũng tƣơng tự với các nghiên cứu của Cheng và cộng sự; Tounier và cộng sự [43]. Do vậy, việc sử dụng Kanamycin với nồng độ 50 mg/l để chọn lọc chồi cây Bạch đàn lai UP chuyển gen ở giai đoạn ra rễ là thích hợp.
3.1.2. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến tỷ lệ tạo mô sẹo
Nghiên cứu xác định tuổi vật liệu thích hợp làm thể nhận gen đƣợc tiến hành với 2 loại vật liệu là đoạn thân và mảnh lá của chồi in vitro ở các độ tuổi
khác nhau tính sau mỗi lần cấy chuyển: 10, 15, 20, 25 ngày tuổi. Các thông số khác đƣợc cố định bởi mật độ vi khuẩn là OD600 = 0,5 với thời gian nhiễm
khuẩn là 10 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ. Sau 3 tuần chuyển gen, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc ở mỗi tuổi chồi khác nhau đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo
Tuổi chồi
in vitro
(ngày)
Số lƣợng mẫu (mẫu)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân
(%)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở mảnh lá (%) 10 250 46,4 41,2 15 250 67,2 62,4 20 250 57,2 52,0 25 250 40,4 37,6 P-value < 0,001 < 0,001
Kết quả thu đƣợc cho thấy, đoạn thân của chồi in vitro có tuổi khác nhau đều cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao hơn so với mảnh lá, tƣơng ứng với mỗi độ tuổi khác nhau thì cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc sau chuyển gen là khác nhau. Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân và mảnh lá đều tăng dần từ chồi in vitro 10 ngày tuổi lên 15 ngày tuổi rồi lại giảm dần xuống.
Kết quả phân tích cho thấy tuổi vật liệu có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng tạo mô sẹo (Pvalue<0,001). Đối với vật liệu là mảnh lá tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc dao động trong khoảng 40,4% - 67,2% đối với đoạn thân, từ 37,6% đến 62,4% đối với mảnh lá và đạt giá trị cao nhất với vật liệu ở 15 ngày tuổi (67,2% và 62,4% tƣơng ứng cho đoạn thân và mảnh lá) (Bảng 3.3, Hình 3.2). Sau 20 ngày tuổi, tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo giảm chỉ cịn 40,4% cho đoạn thân và 37,6% cho mảnh lá (Bảng 3.3). Nhƣ vậy vật liệu nuôi cấu mô ở 15 ngày tuổi là tốt nhất để làm vật liệu nhận gen.
Kết quả sử dụng trụ dƣới lá mầm với các ngày tuổi khác nhau để tạo phôi soma ở Bạch đàn caman cho thấy tuổi vật liệu càng cao thì tỷ lệ tạo mơ sẹo càng thấp. Cụ thể, trụ dƣới lá mầm 10 ngày tuổi cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 66,33%, sau đó tỷ lệ này giảm dần xuống còn 44,36%, 27,67% và 11,67% cho mẫu có độ tuổi là 15, 25 và 30 ngày (theo thứ tự tƣơng ứng) [40].
3.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
Thời gian tiền nuôi cấy là khoảng thời gian mà mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng tái sinh trƣớc khi tiến hành quá trình lây nhiễm vi khuẩn. Trong thời gian này, nhờ vết cắt ở mẫu mà các tế bào và mô của chúng tiến hành quá trình phân chia mạnh mẽ. Sau thời gian tiền nuôi cấy thực hiện chuyển gen sẽ giúp vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng xâm nhập thông qua các tế bào, mô đang phân chia.
Đoạn thân và mảnh lá đƣợc cắt từ chồi in vitro từ 3-5 mm đƣợc đặt trên đĩa petri chứa môi trƣờng tiền nuôi cấy [71]. Chúng đƣợc nuôi cấy cảm ứng trong các thời gian: 0, 24, 48, 72 giờ trƣớc khi thực hiện biến nạp gen. Kết
quả ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen đƣợc thống kê sau 3 tuần chuyển gen thông qua tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo trình bày trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ
mẫu tạo mô sẹo
Công thức Thời gian tiền nuôi cấy (giờ) Số lƣợng mẫu (mẫu) Đoạn thân Mảnh lá Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) ĐC 0 150 47,3 41,3 46,0 36,7 1 24 150 57,3 52,7 52,7 40,0 2 48 150 68,7 64,7 64,7 43,3 3 72 150 50,0 44,7 47,3 33,3 P-value < 0,001 < 0,001
Thời gian tiền ni cấy có ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn thông qua tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (Pvalue<0,001) (Bảng 3.3). Ở công thức đối chứng (ĐC - không thông qua tiền nuôi cấy) cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp nhất trong các cơng thức thí nghiệm, chỉ đạt 41,5 % với đoạn thân và 36,7% đối với mảnh lá. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tăng dần khi tăng thời gian tiền nuôi cấy từ 24 lên đến 48 giờ, cụ thể tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân dao động từ 41,5% - 64,7% và 36,7% - 43,3% ở mảnh lá. Khi thời gian tiền nuôi cấy đạt 48 giờ rồi cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất (64,7% ở đoạn thân và 43,3% ở mảnh lá). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian tiền ni cấy lên 72 giờ thì tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở cả 2 nguồn vật liệu đều giảm xuống (chỉ còn 44,7% ở thân và 33,3% ở lá). Bởi lẽ, khi tăng thời gian tiền nuôi cấy lên qua cao khiến mẫu
biến nạp sẽ có xu hƣớng phát sinh mơ sẹo tại vị trí có vết cắt dẫn đến giảm hiệu quả chuyển gen do vi khuẩn A. tumefaciens khó xâm nhập qua vết
thƣơng của mẫu.
Vì vậy, qua Bảng 3.4 ta có thể thấy rằng thời gian tiền ni cấy có ảnh hƣởng đến khả năng tiếp nhận gen, thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất là 48 giờ trƣớc khi mẫu đƣợc đem biến nạp gen EcHB1. Kết quả này cũng tƣơng tự đối với loài bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla [73], và bạch đàn E. urophylla với tỷ lệ mẫu thân mầm biểu hiện tạm thời gen gus là 41,6%, tỷ lệ mẫu lá mầm biểu hiện tạm thời gen gus là 47,4% [74].
Hình 3.3. Mẫu bật chồi sau chuyển gen khi tiền nuôi cấy 48 giờ
3.1.4. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bởi giá trị quang phổ OD ở bƣớc sóng 600nm của dịch lỏng vi khuẩn, có liên quan tới sinh khối tế bào của chúng hay số lƣợng tế bào trong một thể tích nhất định. Giai đoạn vi khuẩn sinh trƣởng tốt, phát triển mạnh có ý nghĩa quan trọng để hiệu quả chuyển gen đƣợc cao nhất. Thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen đƣợc thử nghiệm ở các mức đo mật độ vi khuẩn OD600 ngƣỡng 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7. Các thông số khác vẫn đƣợc giữ nguyên (thời gian nhiễm khuẩn là 10 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ).
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh Mật độ khuẩn Mật độ khuẩn (OD600) Số mẫu biến nạp Số chồi tái sinh trên MT chọn lọc
Tỷ lệ chồi tái sinh trên MT chọn lọc (%) 0,1 150 6 4,0 0,3 150 8 5,3 0,5 150 10 6,7 0,7 150 7 4,7 P-value < 0,001 < 0,001
Kết quả thu đƣợc cho thấy ở cơng thức thí nghiệm với nồng độ vi khuẩn khác nhau cho tỷ lệ chồi tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc là khác nhau (Pvalue<0,001), chứng tỏ mật độ vi khuẩn có ảnh hƣởng đến tỷ lệ tái sinh chồi Bạch đàn lai UP. Cụ thể, khi thay đổi nồng độ khuẩn từ 0,1 đến 0,5 cho tỷ lệ chồi tái sinh tăng dần, mật độ vi khuẩn ở giai đoạn OD600 = 0,5 cho tỷ lệ
chồi tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc cao nhất 6,7% (Bảng 3.5). Khi tăng nồng độ OD600 = 0,7 tỷ lệ chồi tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc giảm xuống còn 4,7% (Bảng 3.5). Kết quả này có sự tƣơng đồng với kết quả chuyển gen
GA20 vào Bạch đàn uro (E. urophylla) với vật liệu là thân mầm và mảnh lá
mầm cho tỷ lệ tái sinh chồi là cao nhất [75]. Từ kết quả trên chúng tôi lựa chọn OD600 = 0,5 cho quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP.
3.1.5. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
Thời gian nhiễm khuẩn không chỉ quyết định tới khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào mẫu biến nạp mà còn ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng sống sót của mẫu trên mơi trƣờng chọn lọc. Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn tới khả năng tiếp nhận gen đƣợc bố trí với 5 cơng thức ở các khoảng thời gian lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens trong thời gian
0 (không nhiễm khuẩn), 5, 10, 15 và 20 phút. Các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau chuyển gen đƣợc đánh giá sau 2 tuần trên mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung 150 mg/l Km, kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo
Công thức Thời gian nhiễm khuẩn (phút) Đoạn thân Mảnh lá Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%)
Tỷ lệ mẫu sống
(%)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%) ĐC không nhiễm khuẩn 0,0 0,0 0,0 0,0 1 5 43,3 33,3 41,1 23,3 2 10 61,1 44,4 60,0 42,2 3 15 52,2 38,9 44,4 32,2 4 20 35,6 27,8 34,4 26,7 P-value < 0,001 < 0,001
Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với công thức không nhiễm khuẩn cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 0,0%. Các mẫu này không đƣợc chuyển gen mà trực tiếp đặt lên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 150 mg/l Kanamycin, nên chúng khơng có khả năng mang gen nptII mã hóa cho kanamycin phosphotransferase khiến mẫu bị thâm đen và chết. Khi nhiễm khuẩn trong 5 phút, do chƣa đủ thời gian để vi khuẩn xâm nhiễm vào vật liệu nên tỷ lệ mẫu đạt mô sẹo thấp đạt 33,3% và 23,3% (tƣơng ứng với đoạn thân và mảnh lá). Ở thời gian nhiễm khuẩn 10 phút cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần chuyển gen cao nhất đạt 44,4% đối với đoạn thân và 42,2% đối với mảnh lá. Thời gian nhiễm khuẩn càng lâu thì tỷ lệ sống của mẫu càng giảm do mẫu bị ngâm lâu trong dung dịch khuẩn dễ bị úng và nhiễm lại dẫn đến tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo cũng giảm dần. Đối với đoạn thân, tỷ lệ tạo mơ sẹo của mẫu giảm cịn 27,8% sau 20 phút biến nạp. Đối với mẫu lá, tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo giảm cịn 26,7% sau 20 phút biến nạp. Do vậy thời gian nhiễm khuẩn phải đảm bảo làm sao đủ thời gian cho vi khuẩn xâm nhiễm hiệu quả mà mẫu cấy vẫn có sức sống tốt để thuận lợi cho việc tái sinh ở giai đoạn sau và thời gian thích hợp để nhiễm khuẩn là 10 phút.
Hình 3.4. Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút,
20 phút
3.1.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
Thời gian đồng nuôi cấy mẫu là khoảng thời gian mà mẫu cấy sau khi đã lây nhiễm với A. tumefaciens đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đồng nuôi cấy, môi trƣờng này vừa chứa các chất cần thiết cho mô, tế bào thực vật sinh trƣởng và phát triển, lại vừa chứa các yếu tố hoạt hóa q trình chuyển gen