Công thức Thời gian nhiễm khuẩn (phút) Đoạn thân Mảnh lá Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%)
Tỷ lệ mẫu sống
(%)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%) ĐC không nhiễm khuẩn 0,0 0,0 0,0 0,0 1 5 43,3 33,3 41,1 23,3 2 10 61,1 44,4 60,0 42,2 3 15 52,2 38,9 44,4 32,2 4 20 35,6 27,8 34,4 26,7 P-value < 0,001 < 0,001
Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với công thức không nhiễm khuẩn cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 0,0%. Các mẫu này không đƣợc chuyển gen mà trực tiếp đặt lên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 150 mg/l Kanamycin, nên chúng khơng có khả năng mang gen nptII mã hóa cho kanamycin phosphotransferase khiến mẫu bị thâm đen và chết. Khi nhiễm khuẩn trong 5 phút, do chƣa đủ thời gian để vi khuẩn xâm nhiễm vào vật liệu nên tỷ lệ mẫu đạt mô sẹo thấp đạt 33,3% và 23,3% (tƣơng ứng với đoạn thân và mảnh lá). Ở thời gian nhiễm khuẩn 10 phút cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần chuyển gen cao nhất đạt 44,4% đối với đoạn thân và 42,2% đối với mảnh lá. Thời gian nhiễm khuẩn càng lâu thì tỷ lệ sống của mẫu càng giảm do mẫu bị ngâm lâu trong dung dịch khuẩn dễ bị úng và nhiễm lại dẫn đến tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo cũng giảm dần. Đối với đoạn thân, tỷ lệ tạo mô sẹo của mẫu giảm còn 27,8% sau 20 phút biến nạp. Đối với mẫu lá, tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo giảm cịn 26,7% sau 20 phút biến nạp. Do vậy thời gian nhiễm khuẩn phải đảm bảo làm sao đủ thời gian cho vi khuẩn xâm nhiễm hiệu quả mà mẫu cấy vẫn có sức sống tốt để thuận lợi cho việc tái sinh ở giai đoạn sau và thời gian thích hợp để nhiễm khuẩn là 10 phút.
Hình 3.4. Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút,
20 phút
3.1.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo
Thời gian đồng nuôi cấy mẫu là khoảng thời gian mà mẫu cấy sau khi đã lây nhiễm với A. tumefaciens đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đồng nuôi cấy, môi trƣờng này vừa chứa các chất cần thiết cho mô, tế bào thực vật sinh trƣởng và phát triển, lại vừa chứa các yếu tố hoạt hóa q trình chuyển gen của vi khuẩn vào tế bào thực vật. Do vậy, thời gian đồng ni cấy thích hợp sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm và tiến hành q trình chuyển gen vào mơ thực vật, đồng thời sẽ giúp cho bƣớc diệt khuẩn, phục hồi cũng nhƣ chọn lọc về sau đƣợc dễ dàng.
Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đƣợc tiến hành nhằm tìm ra thời gian đồng nuôi cấy phù hợp đảm bảo cho hiệu quả chuyển gen tốt nhất và không ảnh hƣởng đến sức sống và khả năng tái sinh của mẫu cấy sau này. Mẫu qua tiền nuôi cấy trong 48 giờ và đƣợc biến nạp với A. tumefaciens trong 10 phút, sau đó đặt trên mơi trƣờng đồng nuôi cấy
(MS* + 3 mg/l BAP+ 0,5 mg/l NAA + 100 µM AS) trong các khoảng thời gian 24, 48, 72, 96, 120 giờ. Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đƣợc đánh giá sau 2 tuần tiến hành lây nhiễm với A. tumefaciens trên môi trƣờng chọn lọc tạo mô sẹo. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ
mẫu tạo mô sẹo
Công thức Thời gian đồng nuôi cấy (giờ) Đoạn thân Mảnh lá Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) 1 24 58,9 25,6 51,1 23,3 2 48 77,8 47,8 67,8 45,5 3 72 87,8 51,1 85,5 48,9 4 96 74,4 36,7 62,2 35,6 5 120 61,1 33,3 60,0 33,3 P-value < 0,001 < 0,001
Kết quả thí nghiệm cho thấy: thời gian đồng nuôi cấy từ 24 - 72 giờ cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau diệt khuẩn tăng dần, đạt kết quả cao nhất khi đồng nuôi cấy 72 giờ; nhƣng khi kéo dài thời gian đồng nuôi cấy lên 120 giờ thì kết quả mẫu tạo mô sẹo sau diệt khuẩn giảm xuống còn 33,3% ở cả 2 vật liệu chuyển gen này. Kết quả này có thể lý giải là do thời gian đồng nuôi cấy dài đã tạo điều kiện thuận lợi cho A. tumefaciens phát triển nhanh và bao trùm kín tồn bộ mẫu cấy, khiến mẫu cấy bị nhiễm khuẩn nặng, thâm dần và chết. Nhƣ vậy, có thể nhận định rằng, thời gian đồng ni cấy thích hợp nhất cho việc chuyển gen vào Bạch đàn lai UP là 72 giờ, với tỷ lệ mẫu sống sau đồng nuôi cấy là 87,8% ở đoạn thân và 87,5% ở lá, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần
chuyển gen là 48,5% và 49,6% tƣơng ứng ở đoạn thân và mảnh lá. Kết quả này phù hợp với nhận định của Cheng và cộng sự (2006) khi tiến hành chuyển gen trên đối tƣợng bạch đàn E. grandis x E. urophylla cũng nhƣ E. camaldulensis [43].
3.1.7. Hồn thiện quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai
UP
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã hồn thiện quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP với các thông số sau:
- Từ vật liệu ban đầu là đoạn thân và mảnh lá sau 15 ngày nuôi cấy in vitro đƣợc tiền nuôi cấy 48 giờ. Mẫu sau nuôi cấy 48 giờ ở môi trƣờng tiền nuôi cấy đƣợc lắc trong dung dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 = 0,5 khi pha lỗng bng ẵ MS b sung 100àM AS vi thi gian 10 phút. Sau đó thấm khơ mẫu bằng giấy thấm vô trùng đƣợc chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy ở 28oC, trong buồng tối với thời gian là 72 giờ.
- Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, đƣợc rửa bằng nƣớc cất vơ trùng 3-4 lần có bổ sung 500 mg/l Cefotaxim trong 10 phút. Thấm khô mẫu rồi đặt lên môi trƣờng diệt khuẩn và tái sinh chồi có bổ sung 400 mg/l Cefotaxim. Ni trong 5 ngày.
- Mẫu sau 5 ngày trên môi trƣờng diệt khuẩn đƣợc cấy chuyển sang mơi trƣờng tái sinh có bổ sung kháng sinh chọn lọc 400 mg/l Cefotaxim và 150 mg/l Kanamycin. Sau 2-3 tuần, các khối mơ sẹo đƣợc hình thành. Sau khoảng 8 tuần, các khối mô sẹo cảm ứng tạo chồi trên môi trƣờng chọn lọc. Chu kỳ cấy chuyển khối mô sẹo/các chồi đã phát sinh sang môi trƣờng tƣơng tự là 3 tuần/lần.
- Các chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc tách thành từng chồi đơn lẻ, nhân nhanh trên môi trƣờng nhân nhanh bạch đàn bổ sung 150mg/l Km.
Dựa vào quy trình chuyển gen, các thí nghiệm đƣợc tiến hành thực hiện với số lƣợng mẫu lớn nhằm thu đƣợc các chồi sau chuyển gen. Các chồi này
sau đấy đƣợc sàng lọc trên môi trƣờng chọn lọc và đƣợc đánh thành từng dòng riêng rẽ.
Hình 3.6. Mẫu chuyển gen tái sinh trên mơi trƣờng chọn lọc
Chú thích: a, b. Mẫu tạo callus; c, d. Mẫu phát sinh phôi soma;
e, f. Phôi soma bật chồi trên môi trƣờng chọn lọc
3.1.8. Đánh giá khả năng sống sót của chồi chuyển gen
Các chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc sau chuyển gen tiếp tục đƣợc chọn lọc trên mơi trƣờng có bổ sung 150mg/l Km. Các chồi này đƣợc chọn lọc 3 lần, mỗi lần chọn lọc cách nhau 3 tuần. Kết quả chồi sống sót và tỷ lệ chồi sống sau mỗi lần chọn lọc so với tổng số chồi ban đầu đƣợc thể hiện trong Bảng 3.8.