Trong nghiên cứu này, 4 loại hormon steroid (T, 11-KT, E2 và P) trong huyết tương cá Chẽm Mõm Nhọn được phân tích bằng phương pháp miễn dịch liên kết
enzym (Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA). EIA Kit hormon steroid từ
nhà sản xuất (Enzyme Immuno Assay: EIA) Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Phương pháp ELISA lợi dụng sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) để tạo thành cộng hợp kháng nguyên- kháng thể. Cộng hợp kháng nguyên-kháng thể này sẽ tiếp hợp với kháng thể thứ 2
được đánh dấu bằng enzym Acetylcholinesterase (AChE). Phức hợp này sẽ được phát hiện bằng chất hiện màu (Ellman’s Reagent) và đo mật độ quang trên máy quang phổ 96 giếng (Thermo Multiskan EX, Hà Lan) ở bước sóng 405 nm. Phương pháp phân tích được tóm tắt theo trình tự các bước thực hiện như sau:
(1) Dung dịch đệm EIA (EIA buffer) và dung dịch rửa (Wash buffer): Hòa
tan 10 ml dung dịch đệm EIA đậm đặc với 90 ml nước tinh khiết (Merck, Đức). Hòa tan 5 ml dung dịch rửa đậm đặc với 2000 ml nước tinh khiết. Sau đó, hòa tan 1 ml Tween 20 vào dung dịch rửa này trước khi sử dụng. Bảo quản các dung dịch này ở
nhiệt độ 40C.
(2) Mẫu huyết tương: Lấy 0,5 ml mẫu huyết tương hòa tan với 2,5 ml diethyl ether và lắc đều trên máy Vortexer. Để yên trong khoảng 5-10 phút, hỗn hợp sẽ được tách biệt thành 2 lớp. Dùng pipet hút lấy phần dung dịch ở lớp trên trong suốt,
đó là lớp ether có chứa hormon steroid, cho vào trong ống nghiệm mới và lập lại quy trình lần thứ 2 tương tự. Sau khi chiết xuất được phần ether có lẫn hormon steroid, cho bay hơi hết ether, hormon steroid còn lại sẽ lắng tụ ởđáy và thành của
ống nghiệm. Đưa 0,5 ml dung dịch đệm EIA vào ống nghiệm và lắc đều, đảm bảo hòa tan được hormon steroid với dung dịch đệm EIA.
(3) Hormon steroid chuẩn: Dùng pipet lấy 100 µl hormon steroid chuẩn trong bộ kit của nhà cung cấp cho vào ống nghiệm sạch. Sau đó hòa tan hormon steroid chuẩn này với 900 µl nước tinh khiết bằng máy lắc đảo Vortexer. Sau đó chuẩn bị 8
ống nghiệm sạch và đánh dấu từ 1 đến 8. Đưa 900 µl dung dịch đệm EIA vào ống nghiệm số 1 và 500 µl dung dịch đệm EIA vào các ống nghiệm 2 đến 8. Chuyển 100 µl hormon steroid chuẩn đã hòa tan vào ống nghiệm 1 lắc đều, sau đó lấy ra 500 µl
đưa vào ống nghiệm 2 và lắc đều. Tiếp theo, lấy ra 500 µl từống nghiệm 2 và đưa vào ống nghiệm 3 và lắc đều. Tương tự như vậy, thực hiện cho đến ống nghiệm thứ
8. Cuối cùng ta có dung dịch chuẩn với 8 nồng độ khác nhau. Dung dịch đánh dấu (hormon steroid AchE Tracer) pha chế bằng cách hòa tan 100 dtn hormon steroid với 6 mL EIA buffer. Kháng nguyên (hormon steroid EIA antiserum) cũng được pha chế bằng cách hòa tan 100 dtn hormon steroid antiserum với 6 ml EIA buffer. Nồng độ các dung dịch chuẩn của các hormon steroid được sử dụng trong phân tích
được trình bày ở Bảng 2.1.
(4) Phân tích mẫu: Dùng micropipet hút 50 µl các dung dịch đã chuẩn bị (EIA buffer, dung dịch chuẩn, mẫu, chất đánh dấu enzym và kháng nguyên) đưa vào đĩa nhựa 96 giếng theo sơđồ phân tích đã bố trí sẵn. Sau đó, đĩa nhựa được ủ trên máy lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng (25-280C) trong thời gian 1-2 giờ tùy theo từng loại hormon steroid cần phân tích. Tiếp theo, rửa sạch các giếng và đưa cơ chất (Ellman’s reagent) vào các giếng trên đĩa, tiếp tục ủ đĩa trong thời gian 60-90 phút. Cuối cùng, đo mật độ quang của các giếng trên đĩa nhựa ở bước sóng 405 nm trên máy quang phổ ELISA.
Bảng 2.1: Nồng độ các hormon steroid chuẩn (pg/ml)
Thứ tự Testosteron 11-Ketotestosteron Estradiol 17-β Progesteron
1 250,00 640,00 100,00 250,00 2 125,00 256,00 50,00 125,00 3 62,50 102,40 25,00 62,50 4 31,30 41,00 12,50 31,30 5 15,60 16,40 6,25 15,60 6 7,80 6,60 3,13 7,80 7 3,90 2,64 1,56 3,90 8 1,95 1,06 0,78 1,95
(5) Đường chuẩn và tính toán kết quả: Đường chuẩn được xây dựng trên cơ
sở các nồng độ hormon steroid chuẩn (pg/ml) đã được chuẩn bị trước (X) và %B/Bo của các hormon steroid chuẩn (Y). Dựa vào phương trình Y = aLn(X) + b, hàm
lượng hormon steroid trong mẫu được tính theo hàm số X = exp ((y-b)/a). Trong đó X là hàm lượng hormon steroid có trong mẫu, y là %B/Bo của mẫu, a và b là các hằng số.
Hình 2.4: Đường chuẩn của các hormon steroid và phương trình tương quan