Kháng thể PEDV đặc hiệu được xác định ở dịch đường tiêu hĩa khi dùng phương pháp phát hiện ELISA phân tách IgG và IgA. IgA ưu thế ở đường tiêu hĩa hơn kháng thể IgG (Bjustrom-Kraft & cs., 2016), IgA kháng được enzym đường tiêu hĩa (Offit & Clark., 1985). Khi kháng nguyên tiếp xúc với cơ quan miễn dịch tại đường ruột, tế bào tiết IgA được kích thích hình thành kháng thể IgA ở niêm mạc đường ruột và sản xuất IgA ở tuyết vú. Tuy nhiên, IgG được định lượng nhiều hơn 60% lượng glubunin trong sữa non. Đề cập IgA hay kháng thể trung hịa cĩ vai trị bảo vệ động vật tránh khỏi dịch PED, đã cĩ báo cáo khoa
học ghi nhận: hiệu quả bảo hộ của vắc xin liên quan chính đến vai trị của kháng thể trung hịa đặc hiệu cĩ trong huyết thanh và trong sữa của lợn nái được tiêm vắc xin (Collin & cs., 2017; Lee, 2017). Kháng thể trung hịa được coi như là yếu tố gián tiếp đánh giá khả năng bảo hộ của vắc xin PED.
2.3.3. Vắc xinphịng bệnh PED
Nghiên cứu vắc xin để sử dụng cho lợn nái với đích đến là bảo vệ lợn con theo mẹ, lợn con được nhận được kháng thể mẹ truyền qua sữa và được bảo vệ. Mặc dù PEDV nổ ra ở châu Âu, nhưng bệnh khơng gây thiệt hại lớn về kinh tế đến mức phát triển một loại vắc xin cĩ hiệu quả trong thời điểm trước năm 2013.
Tháng tư năm 2013 PEDV bùng phát với dịng độc lực mạnh và lây lan nhanh tồn thế giới. Bệnh PED ở châu Á nghiêm trọng hơn, đánh dấu bởi vụ dịch xảy ra năm 2010 ở Trung Quốc, sau đĩ báo cáo ghi nhận ở các Quốc gia châu Á khác. Nhiều loại vắc xin đã được phát triển, ở Trung Quốc cĩ vắc xin nhược độc CV777 hoặc vắc xin vơ hoạt CV777, ở HànQuốc cĩ vắc xin dịng DR13, SM98, Nhật Bản cĩ vắc xin 83P-5. Việc nhược độc hĩa virus từ các dịng virus cường độc thơng qua việc cấy chuyển virus nhiều đời trên tế bào (93 đến 100 đời) làm giảm độc lực của virus, đột biến nucleotid và thay thế aa trong gene S của PEDV cĩ thể gĩp phần nhược độc hĩa virus. Ở Hàn Quốc, quy trình miễn dịch 3 đến 4 mũi vắc xin trên lợn nái sinh sản, mỗi mũi cách nhau 2 đến 3 tuần. Lợn nái mang thai trước đẻ 5 tuần và 3 tuần tiêm tiêm vắc xin đã duy trì kháng thể trung hịa
cao trong huyết thanh và trong sữa đầu, làm tăng tỉ lệ sống sĩt của lợn con từ 18.2% đến trên 80% khi thử thách với chủng cường độc thực địa. Mặc dù vậy, việc bảo vệ lợn chống lại bệnh cịn phụ thuộc hiệu quả vắc xin cĩ thể liên quan đến duy trì mức độ kháng thể trung hịa đặc hiệu trong huyết thanh và sữa đầu của lợn nái (Park, 2009).
Hiện nay, các vắc xin đề cập ở trên, hình thành trước năm 2013, chỉ cĩ hiệu quả từ mức độ thấp tới trung bình bởi kháng nguyên và tính di truyền của PEDV cĩ sự thay đổi (sự thay đổi khi >10% amino axít biến đổi giữa Protein S). Do sự đa dạng về di truyền giữa dịng vắc xin và dịng cường độc thực địa, PEDV dịng 2b hoặc các dịng liên quan thực địa được dùng để phát triển vắc xin kiểm sốt bệnh PED, hay vắc xin tiểu phần (S1) cho việc phịng ngừa PEDV trong tương
lai (Oh & cs., 2014). Ở Hàn Quốc, dịng PEDV thực địa thuộc nhĩm 2b đã được phân lập và đang phát triển vắc xin, bước đầu cho thấy an tồn và hiệu quả (Lee & cs., 2010; Oka & cs., 2014).
Một số liệu pháp miễn dịch đã được sử dụng khi bệnh PED nổ ra nghiêm trọng và cấp tính. Một số trang trại dùng virus tại chỗ (autogenous) cho lợn nái đang mang thai ăn ruột non từ bệnh phẩm của những lợn con nhiễm PEDV. Tuy
nhiên, hiệu quả hạn chế bởi hiệu giá virus PED khơng đủ cung cấp miễn dịch bảo
vệ đàn con sau sinh. Ngồi ra nguồn virus nhiễm nhân tạo sẽ ẩn nấp trong phân, trong động vật khỏe mang trùng, bệnh PED sẽ quay lại với vụ dịch mới và mùa dịch mới (Changhee, 2015).
2.3.4. Phản ứng chéo huyết thanh học
TGEV và PEDV là 2 virus được phân loại thuộc nhĩm Alphacoronavirus.
infectious peritonitis virus (FIPV), và Canine coronavirus. Hầu hết các nghiên cứu trước đã báo cáo phản ứng của vật chủ với PEDV CV777 cổ điển và các dịng PEDV biến thể khơng cĩ phản ứng chéo huyết thanh học với các dịng
Coronaviruses khác. Phản ứng kháng nguyên của PEDV và TGEV cũng khác nhau (Saif, 2016). Một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng cĩ trung hịa chéo yếu giữa PEDV và các virus thuộc nhánh Alphacoronaviruses. Tuy nhiên, một suy đốn rằng huyết thanh thu thập từ thực địa biểu hiện phản ứng chéo yếu với PEDV cĩ thể do tương tác nền của phản ứng hay phản ứng khơng đặc hiệu, độ nhạy và độ đặc hiệu của các phản ứng khác nhau. Đây cĩ thể cũng là lý do tại sao kháng nguyên phản ứng chéo giữa PEDV và TGEV được ghi nhận khơng thường xuyên, và mức độ chéo thấp (Saif, 2016).
Kháng nguyên của các dịng PEDV mới nổi cũng bị thay đổi dựa phân tích trình tự gen.Mặc dù kháng nguyên khác nhau giữa dịng cổ điển và dịng cĩ độc lực cao được nghiên cứu, nhưng đa dạng kháng nguyên giữa các dịng PEDV trong cùng nhánh phân loại gen ít được nghiên cứu huyết thanh học. Epitope trung hịa của dịng CPV777 cổ điển thì giống như epitope dịng PEDV SM98 cổ điển. Nghiên cứu về huyết thanh học, khả năng trung hịa chéo giữa dịng mới nổi cĩ độc lực thấp (S-INDEL) và dịng mới nổi cĩ độc lực cao (non-S INDEL), kết quả hiệu giá kháng thể trung hịa đồng chủng cao hơn hiệu giá dị chủng 4 lần, giữa huyết thanh kháng PEDV của dịng CV777 cổ điển với virus đồng chủng cao hơn hiệu giá kháng thể trung hịa dị chủng 16 lần (Chen & cs., 2016), thể hiện trong nghiên cứu trước ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Phản ứng trung hịa chéo giữa các chủng PEDV và 2 chủng TGEV
Hiệu giá kháng thể trung hịa
Huyết thanh kháng các Dịng virus: Dịng virus PEDV PC22A độc lực cao S INDEL Iowa106 S 197 DEL PC 177 CV777 cổ điển PC22A độc lực cao* 1024a 1024 1024 64 S INDEL Iowa106** 16 64a 64 16 S 197 DEL PC 177* 256 256 256a 256 CV777 cổ điển* 512 512 512 512a TGEV dịng Miller ** < 4 < 4 < 4 < 4 TGEV dịng Purdue** < 4 < 4 < 4 < 4
Ghi chú: * Huyết thanh lợn hồi phục, ** huyết thanh lợn tối miễn dịch ( a ) phản ứng đồng chủng
Nghiên cứu của các nhà khoa học về sự biến đổi gen và biến đổi kháng nguyên của các dịng PEDV để từ đĩ kiểm sốt dịch PED nổ ra và để phát triển vắc xin phù hợp. Theo các tài liệu mơ tả trước đây (Rweyemamu & Hingley, 1984; Ngơ Thanh Long & cs., 2016)và tài liệu OIE năm 2009, phương pháp tin cậy nhất là miễn dịch vắc xin cho bản động vật, sau đĩ cơng thử thách với mỗi chủng virus phân lập khác nhau, sẽ trả lời chính xác hiệu lực và tính kháng chéo tồn diện nhất. Những vấn đề về an tồn, độ lặp lại và tốn kém tài chính, thời gian, nên việc sử dụng thay thể bằng phương pháp huyết thanh học trong phịng thí nghiệm (in vitro) là cần thiết (Lin & cs., 2015).
So sánh miễn dịch chéo là so sánh cặp đơi giữa một huyết thanh miễn dịch của 1 chủng virus phản ứng từng cặp một với các dịng virus khác nhau, sự tương quan huyết thanh học được tính tốn bởi tỉ số r (Ratio serological relatedness)
(Rweyemamu, 1978). r =
Hiệu giá kháng thể trung hịa dị chủng Hiệu giá kháng thể trung hịa đồng chủng
Một số hạn chế của phản ứng chéo (Chen, 2016): (1) kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cĩ thể cĩ phản ứng nền khơng đặc hiệu bởi động vật thí nghiệm. (2) Huyết thanh miễn dịch mỗi chủng tại thực địa chứa kháng thể đa dịng, cĩ thể huyết thanh phản ứng bởi các epitope khơng phải epitope trung hịa. (3) Khơng bộc lộ kháng thể miễn dịch qua trung gian tế bào của vật chủ với virus.
2.4. TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
Các phản ứng phát hiện kháng thể kháng PEDV trong huyết thanh, trong sữa, trong phân và dịch đường tiêu hĩa gồm cĩ phản ứng phát hiện kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Immunofluorescence assay-IFA), phản ứng trung hịa
virus (Virus Neutralisation Test - VNT), phản ứng miễn dịch liên kết enzym
(enzym-linked immunosorbent assay - ELISA). Mỗi phản ứng cĩ ưu điểm riêng nhằm phát hiện kháng thể. Chúng là các cơng cụ quan trọng để đánh giá phản ứng sinh kháng thể của cơ thể vật chủ sau khi nhiễm PEDV, xác định sự phơi nhiễm PEDV trong đàn, hay dùng đánh giá hiệu quả của vắc xin trong chiến lược dùng vắc xin. Phản ứng huyết thanh học hữu ích trong việc tầm sốt kháng thể mẹ truyền bảo vệ đàn con sơ sinh. Đến nay chỉ xác định được 1 serotype huyết thanh học của PEDV (Lin & cs., 2015; Qi & cs., 2016).
2.4.1. Phản ứng trung hịa virus
Như đã đề cập, protein S coi như là đích kháng nguyên đầu tiên để phát triển vắc xin cĩ hiệu quả chống lại Coronaviruses (Gallagher & Buchmeier, 2001). Một phần glycoprotein S cĩ vai trị bám dính với thụ thể của tế bào vật chủ, một phần tạo điều kiện dung hợp vỏ virus với lớp màng tế bào vật chủ và cho phép bộ gen của virus xâm nhập vào vật chủ (Yoo & cs., 1991). Protein S
chứa epitope trung hịa chính của virus PED (Chang & cs., 2002), Protein S của TGEV cũng tương tự chứa đựng epitope trung hịa (Duarte & cs., 1994).
Phản ứng trung hịa virus được dùng rộng rãi để xác định kháng thể trung
hịa virus PEDV (Okda & cs., 2015). Cơ chế trung hịa virus được xác định như là sự giảm virus nhiễm bởi sự gắn kết kháng thể với virion, kháng thể trung hịa khĩa một hoặc nhiều giai đoạn khi virus tiếp xúc/xâm nhập với tế bào vật chủ.
Nguồn: Klasse (2014)
Ghi chú: Hình trịn màu xanh nam to nhất là mơ hình tế bào vật chủ, kháng thể trung hịa cĩ biểu tượng hình chữ Y, 6 hình trịn nhỏ là mơ hình virus ở các giai đoạn xâm nhập khác nhau.