Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa mới được thiết lập và tối ưu được tính tốn trên cơsở so sánh với kết quả của phản ứng ELISA cơ sở. Kết quả biểu diễn mối tương quan giữa hiệu giá trung hịa và giá trị OD450 được trình bày ở Hình 4.8.
Ghi chú: mỗi mẫu huyết thanh (biểu diễn bởi 1 chấm trịn) được xét nghiệm bằng phản ứng trung hịa và ELISA để xác định hiệu giá trung hịa và giá trị OD450. Mẫu được đánh giá là cĩ kháng thể trung hịa
nếu cĩ hiệu giá tối thiểu là 5 log2 (giới hạn bởi đường nét đứt).
Hình 4.8. Tương quan giữa hiệu giá trung hịa và giá trị OD
Kết quả cho thấy ở một hiệu giá trung hịa cố định, giá trị OD450 cĩ khoảng biến động lớn, ví dụ giá trị OD450 dao động từ 0,21 – 0,74 đối với nhĩm gồm 30
mẫu cĩ hiệu giá trung hịa là 6 log2 (mũi tên, Hình 4.9). Ở chiều ngược lại, phản ứng trung hịa (liên quan tới khả năng bảo hộ chống lại cơng cường độc) thể hiện ưu điểm hơn so với phản ứng ELISA. Ví dụ, phản ứng trung hịa cho biết nhĩm mẫu huyết thanh cĩ giá trị OD450 = 0,6 khơng cĩ tính đồng nhất về hiệu giá trung hịa, biến động từ 5 log2 đến 9 log 2 (vùng đĩng khung, Hình 4.8).
Từ cơng thức tính (Pearson Correlation Coefficient Calculator), đã xác định cĩ tương quan tỷ lệ thuận giữa giá trị OD450 và hiệu giá kháng thể trung hịa (giá trị Pearson's R = 0,61). Kết quả này là phù hợp với một số nghiên cứu trước đây khi đều xác định được tương quan giữa kết quả phát hiện kháng thể kháng PEDV bằng phản ứng trung hịa và phản ứng ELISA (Oh & cs., 2005; Paudel & cs., 2014a; Hao & cs., 2017). Mặc dù cĩ ý nghĩa thống kê (p < 0,00001) nhưng tương quan kể trên chỉ ở mức trung bình. Điều này được giải thích là do trong thành phần huyết thanh của lợn cĩ nhiều lớp kháng thể trung hịa PEDV (ví dụ như IgG, IgA) nhưng phản ứng ELISA dùng trong nghiên cứu này chỉ phát hiện được lớp kháng thể IgG (Oh & cs., 2005). Trong các nghiên cứu tiếp theo nhằm hồn thiện phản ứng trung hịa virus, cần sử dụng thêm các kỹ thuật phát hiện được lớp kháng thể đặc hiệu IgG và IgA (hoặc sIgA tiết qua sữa), ví dụ như kỹ thuật
alphaELISA (Kimpston-Burkgren & cs., 2020). So sánh kết quả phát hiện mẫu âm tính/ dương tính với kháng thể kháng PEDV được tĩm tắt ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa Kết quả trung hịa Kết quả ELISA Tổng hàng Dương tính Âm tính Dương tính (≥ 5 log2)* 125 1 126 Âm tính (< 5 log2) 18 54 72 Tổng cột 143 55 198
Độ nhạy của phản ứng trung hịa so sánh với phản ứng ELISA: 87,46%
Độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa so sánh với phản ứng ELISA: 98,18%
Ghi chú: (*) mẫu huyết thanh ở độ pha lỗng > 1/20 làm giảm 90% số tế bào nhiễm PEDV giảm so đối chứng âm được xác định là cĩ kháng thể trung hịa (Clement và cs., 2016). Trong nghiên cứu này lấy giá trị ngưỡng dương tính của kháng thể trung hịa là ≥ 5 log2
Bảng 4.3 cho biết phần lớn các mẫu (125/198 mẫu dương tính, 54/198 âm tính) đều cĩ kết quả phát hiện giống nhau giữa hai phương pháp. Dựa vào cơng thức tính, độ nhạy của phản ứng trung hịa so với phản ứng ELISA cơ sở là 87,46% và độ đặc hiệu là 98,18 %. Sự khơng phù hợp hồn tồn giữa kết quả của phản ứng trung hịa và phản ứng ELISA đã được chỉ ra ở một vài nghiên cứu tương tự (Oh & cs., 2005; Okda & cs., 2015). Đặc điểm này cũng quan sát được ở nghiên cứu này: cĩ 18 mẫu được xác định là âm tính giả (kết quả phát hiện kháng thể trung hịa so với kết quả phát hiện kháng thể lớp IgG tổng số bằng ELISA). Sự khác biệt trên cĩ thể do một số nguyên nhân. Thứ nhất, phản ứng trung hịa phát hiện kháng thể làm mất hoạt tính nhiễm của virus (kháng thể trung hịa). Trong khi đĩ, protein bề mặt của virus (ví dụ như protein S) lại bao gồm các epitope kích thích sản sinh kháng thể trung hịa và kháng thể khơng cĩ khả năng trung hịa virus (Song & cs., 2016). Ngồi ra, thời điểm xuất hiện kháng thể trung hịa và đạt hiệu giá cao nhất thường chậm hơn so với kháng thể khơng cĩ tác dụng trung hịa virus (Okda & cs., 2015; Thomas & cs., 2015).
4.3.2. Độ nhạy, độđặc hiệu của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC
Thẩm định phương pháp là nhu cầu thiết yếu khi triển khai áp dụng một phương pháp xét nghiệm mới. Trong thí nghiệm này, mẫu huyết thanh chuẩn phịng thí nghiệm (gọi là mẫu chuẩn QC) được dùng làm mẫu nền, mẫu chuẩn QC được pha lỗng ở các các độ pha lỗng từ 1/2 đến 1/512, mỗi độ pha lỗng lặp lại 8 lần và thực hiện phản ứng ELISA kết quả được ghi lại Hình 4.9
Phản ứng ELISA trên nền mẫu chuẩn QC từ huyết thanh nguyên tới độ pha lỗng 1/512, màu vàng trong giếng phản ứng biểu hiện dương tính, màu trắng biểu hiện âm tính. Kết quả dựa vào giá trị ngưỡng OD450 ≥ 0,225 đểkết luận mẫu dương tính.
Theo ISO-17025 việc thẩm định một quy trình được thực hiện trên mẫu điển hình, hoặc so sánh kết quả với 1 phương pháp khác tin cậy. Nền mẫu được
pha lỗng thành các nồng độ khác nhau (nồng độ thấp, trung bình, cao) hoặc trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ làm lặp lại ít nhất 6 lần, từ đĩ tính độ nhạy, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính. Kết quả được trình bày Bảng 4.4.
Bảng 4.4. Tương quan giữa ELISA và VNT trên nền mẫu chuẩn QC Độ pha lỗng
mẫu chuẩn QC Hiệu giá VNT
Số lần lặp lại
Phản ứng ELISA cơ sở
Số mẫu
dương tính Số mẫu âm tính
1/1 210 8 8 0 1/2 29 8 8 0 1/4 28 8 8 0 1/8 27 8 8 0 1/16 26 8 8 0 1/32 25(*) 8 8 0 1/64 24 8 0 8 1/128 23 8 0 8 1/256 22 8 0 8 1/512 21 8 0 8
Tổng số mẫu: 50 mẫu 32 mẫu
Độ nhạy của phảnứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC: 100% Độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC: 100%
Ghi chú: (*) ngưỡng dương của phản ứng trung hịa ≥ 25
Kết quả trên cho thấy tại độ pha lỗng của mẫu chuẩn QC (quanlity control) 1/32 tương ứng kháng thể trung hịa đạt 25 thì ELISA dương tính 8/8 mẫu. Khi so sánh giá trị OD450 và hiệu giá kháng thể trung hịa thì cĩ tương quan tỷ lệ thuận (giá trị Pearson's R = 0,93) và cĩ ý nghĩa thống kê (p < 0,00001), hiệu giá kháng thể trung hịa từ 25 khi so sánh với phản ứng ELISA thì độ nhạy và độ đặc hiệu đều đạt 100%. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu dựa trên nền mẫu chuẩn QC cao hơn độ nhạy và độ đặc hiệu mẫu thu thập thực địa. Mẫu thực địa tiềm ẩn yếu
tố khơng đặc hiệu: kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cĩ thể cĩ phản ứng nền khơng đặc hiệu bởi động vật thí nghiệm. Huyết thanh phản ứng bởi các epitope khơng phải epitope trung hịa (Chen, 2016). Khi dùng mẫu chuẩn QC làm nền mẫu thì lúc này thí nghiệm được so sánh chỉ cĩ 1 yếu tố thay đổi, đĩ là so sánh 2 phương pháp huyết thanh học (phương pháp VNT và ELISA) nên kết quả tin cậy hơn. Với các minh chứng trên, phản ứng trung hịa đủ điều kiện để ứng dụng nghiên cứu huyết thanh học.
4.3.3. Phảnứng trung hịa xác định kháng thể ởhuyết thanh và sữa đầu
Ứng dụng phản ứng trung hịa xác định kháng thể trung hịa trong mẫu huyết thanh của nái mẹ, huyết thanh lợn con mới sinh 2-3 ngày tuổi và sữa đầu của mẹ. Kết quả ứng dụng phản ứng trung hịa trong khảo sát kháng thể của các cặp lợn nái- lợn con (sau bú sữa đầu) ở một số trang trại được trình bày ở
Hình 4.10.
Ghi chú: hiệu giá kháng thể trung hịa ở nhĩm lợn nái và lợn con của chúng (A). Mẫu huyết thanh và sữa đầu được lấy ở cùng nhĩm lợn nái. Mẫu huyết thanh của lợn con thu thập 2 ngày sau khi bú sữa đầu
(D2). Hiệu giá kháng thể trung hịa biểu diễn cho từng nhĩm mẫu (B).
Hình 4.10A cho biết phản ứng trung hịa cĩ thể phát hiện được kháng thể trung hịa ở 2 loại mẫu khác nhau (huyết thanh- sữa đầu). Trong cùng nhĩm lợn, cĩ thể thấy kháng thể trong sữa non cao hơn hẳn so kháng thể trong huyết thanh mẹ (p < 0,05). Đặc điểm trên phù hợp với kết quả đã cơng bố (Clement & cs., 2016) và phản ánh đặc điểm sinh lý tiết sữa với hàm lượng IgG, IgM và IgA ở sữa đầu luơn cao hơn tối thiểu 2 lần so với hàm lượng trong máu lợn nái (Porter, 1969). Khi tổng hợp kết quả theo nhĩm lợn, dễ dàng thấy rằng phản ứng trung hịa mới thiết lập cịn phát hiện được sự biến động về hiệu giá kháng thể trung hịa ở mỗi nhĩm lợn (Hình 4.10B), đặc biệt là nhĩm lợn con theo mẹ với khoảng biến động từ 5 log2- 10 log2. Đây cĩ thể dolợn nái cĩ hàm lượng kháng thể thấp và/ hoặc lợn con tiếp nhận kháng thể truyền qua sữa đầu khơng đồng đều.
Như vậy, các kết quả nêu trên đã chứng tỏ phản ứng trung hịa được thiết lập thành cơng. Mặc dù vậy, cần ứng dụng phản ứng trung hịa với một dung
lượng mẫu lớn hơn để tiếp tục đánh giá chất lượng cũng như hồn thiện các điểm yếu cĩ thể được phát hiện trong quá trình thực hiện.
4.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNGMIỄN DỊCH CHÉO GIỮA CÁC CHỦNG
4.4.1. Chế huyết thanh thỏ kháng các chủng PEDV thực địa
Xác định khả năng miễn dịch của mỗi chủng virus PEDV được thực hiện bằng cách tối miễn dịch trên thỏ thu huyết thanh miễn dịch và đánh giá hàm lượng kháng thể trung hịa. Kết quả được biểu diễn Hình 4.11
Hình 4.11 chỉ ra huyết thanh thỏ tối miễn dịch mỗi chủng PEDV được khảo sát huyết thanh định kỳ 7 ngày 1 lần, kết quả huyết thanh thỏ trước khi miễn dịch (ký hiệu D0) và sau miễn dịch 7 ngày (ký hiệu D7) kháng thể trung hịa âm tính. Kháng thể trung hịa bắt đầu xuất hiện từ D14 sau miễn dịch, huyết thanh thỏ D14, D21, D28, D35, D42 cả 5 chủng PEDV đều sinh kháng thể trung hịa, khơng cĩ sự khác nhau hiệu giá kháng thể giữa các chủng (p=0,075>0,05).
Trong khi thỏ đối chứng cho kết quả âm tính. Đề cập thời gian xuất hiện kháng thể trung hịa trên lợn nhĩm tác giả (Diel & cs., 2016) cho biết kháng thể trung hịa bắt đầu xuất hiện trong huyết thanh lợn từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 sau khi nhiễm PEDV và cao nhất 21 ngày, kéo dài tới 6 tháng. Trong thí nghiệm này,
chúng tơi đã tạo được huyết thanh thỏ kháng mỗi chủng PEDV chứa kháng thể trung hịa PEDV, là nguyên liệu đánh giá khả năng kháng chéo giữa các chủng.
4.4.2. Đánh giá khảnăng trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
4.4.2.1. Khả năng trung hịa các chủng virus của huyết thanh kháng PEDV 0118
Các tài liệu mơ tả trước đây (Rweyemamu, 1978; Long, 2016; OIE, 2009) cho biết: phương pháp tin cậy nhất để đánh giá một chủng virus cĩ khả năng miễn dịch chéo với chủng virus khác là chỉ số miễn dịch bảo hộ chéo trên bản động vật, điều đĩ sẽ trả lời chính xác hiệu lực và tính kháng chéo tồn diện nhất. Nhưng liên quan an tồn sinh học và các vấn đề khác, nên việc sử dụng phương
pháp huyết thanh học thay thế, được thực hiện trong phịng thí nghiệm (in vitro) được tổ chức OIE khuyến cáo nên dùng. Hình 4.12 (trang bên) mơ tả khả năng trung hịa chéo của huyết thanh thỏ kháng PEDV 0118 với các dịng PEDV thuộc
genogroup G1 và genogroup G2.
Hình 4.12 cho thấy, bệnh tích tế bào (CPE - cytopathic effects) được quan sát qua nhuộm miễn dịch, CPE đặc trưng bởi tế bào nhiễm virus hợp nhất màng nguyên sinh chất thành cụm tế bào đa nhân hay gọi là thể hợp bào. Trong thí
nghiệm này thấy rằng với cách đánh giá phản ứng trung hịa như đã thiết lập (phản ứng dương tính khi số cụm CPE giảm hơn 90% so với đối chứng ở mỗi nồng độ pha lỗng huyết thanh) thì hiệu giá kháng thể trung hịa của chủng PEDV 0118 được xác định là 256 khi phản ứng với các chủng thuộc nhĩm G2 (đồng nhĩm) trong khi phản ứng chéo với PED từ vắc xin (thuộc nhĩm G1) thấp hơn 2 lần.
Ghi chú: dương tính (+) , âm tính (-); HT: huyết thanh; PEDV VX: Virus PED cĩ nguồn gốc từ vắc xin nhược độc thuộc nhĩm G1; VNT- virus neutralizing test- hiệu giá kháng thể trung hịa -hiệu giá kháng thể trung hịa được xác định dương tính khi cĩ số tế bào nhiễm virus giảm hơn 90% so đối chứng âm.
Hình 4.12. Huyết thanh kháng PEDV 0118 phản ứng với các chủng PEDV
Từ năm 2013 vụ dịch PEDV bùng phát trở lại ở Mỹ là mốc thời gian xác định sự biến đổi, cĩ sự đa dạng kháng nguyên giữa dịng cổ điển và dịng mới nổi
(Wang & cs., 2013). Vắc xin PED cĩ nguồn gốc từ các dịng PEDV cổ điển đã khơng bảo vệ hồn tồn được đàn lợn hoặc đã thất bại ở châu Á. Hơn nữa, nghiên cứu tính kháng chéo của kháng nguyên dựa trên các dịng mới nổi thấy rằng, chỉ cĩ sự bảo vệ chéo một phần giữa dịng cổ điển và dịng mới nổi cĩ độc lực cao (Chen, 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tơi cũng thấy rằng cĩ sự khác biệt khả năng kháng chéo giữa kháng thể trung hịa của dịng mới nổi với dịng PEDV cổ điển, nhưng kháng chéo giữa chủng PEDV 0118 với các dịng trong cùng nhĩm G2 lại khơng cĩ sự khác biệt.
4.4.2.2. Kết quả hiệu giá kháng thể trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
Sau khi thích nghi được PEDV thực địa trên tế bào Vero và xây dựng được phản ứng trung hịa với các chủng virus này, thì việc nghiên cứu đã đủ điều kiện để thực hiện phản ứng chéo huyết thanh học giữa các chủng PEDV. Phản ứng trung hịa chéo giúp đánh giá các chủng PEDV thuộc nhĩm G2 cĩ hay khơng mối quan hệ huyết thanh học với PEDV thuộc nhĩm G1 và ngược lại. Phản ứng trung hịa chéo được thực hiện giữa mỗi cặp đơi của huyết thanh kháng PEDV đồng chủng và PEDV dị chủng. Kết quả được trình bày Bảng 4.5.
Bảng 4.5. Hiệu giá kháng thể trung hịa chéo giữa các chủng PEDV Chủng virus
Hiệu giá trung hịa chéo PEDV theo nhĩm di truyền
Nhĩm 01 (G1) Nhĩm 02 (G2)
PEDV VX PEDV0116 PEDV 0117 PEDV 0317 PEDV 0118 PEDV 0116 128 512a 128 32 256 PEDV 0117 32 128 128a 32 256 PEDV 0317 32 256 128 64a 256 PEDV 0118 32 128 64 32 256a PEDV VX 256a 64 64 64 128
Ghi chú: Số in đậm và (a) trong bảng là kết quả hiệu giá kháng thể trung hịa đồng chủng
Kết quả trên thấy rằng, hiệu giá kháng thể trung hịa của huyết thanh thỏ kháng dịng PEDV vắc xin thuộc G1 phản ứng với virus đồng chủng là 256 cao hơn so với khi phản ứng với PEDV dị chủng thuộc dịng G2 từ 2 đến 8 lần.
Trong khi đĩ hiệu giá kháng thể trung hịa chéo của các chủng PEDV thuộc G2 giữa đồng và chéo chủng chênh nhau 2 đến 4 lần. Liên quan tính kháng chéo, tác giả (Chen, 2016) đã ghi nhận hiệu giá kháng thể trung hịa kháng PEDV chủng cổ điển với virus đồng chủng cao hơn hiệu giá chéo chủng từ 8 đến 32 lần, giao động tùy thuộc các chủng thực địa khác nhau. Dữ liệu trong nghiên cứu này, chúng tơi đã minh chứng rằng vắc xin PEDV từ dịng cổ điển chỉ trung hịa chéo được 1 phần với PEDV dịng mới nổi (genogroup G2) tại miền Bắc Việt Nam.
Theo tài liệu của OIE tái bản năm 2009 để xác định sự phù hợp của vắc xin hay lựa chọn chủng virus sản xuất vắc xin, thì một trong số phân tích cần làm: đáp ứng miễn dịch chéo của mỗi chủng trong điều kiện phịng thí nghiệm (in vitro) tiến hành bằng cách xác định chỉ số r1, r1 càng tiến tới 1 thì kháng nguyên
giữa các chủng tương đồng càng cao. Trong nghiên cứu này, giá trị r1 của các chủng PEDV được trình bày ở Hình 4.13dưới đây.
Ghi chú: HTK: huyết thanh kháng; giá trị r1 là tỉ số giữa hiệu giá kháng thể kháng virus di chủng và hiệu giá kháng thể kháng virus đồng chủng
Hình 4.13. Giá trị r1 biểu diễn khả năng trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
Hình 4.13. Cho thấy, giá trị r1 biểu diễn khả năng trung hịa chéo giữa huyết thanh kháng mỗi chủng PEDV phản ứng với 5 chủng PEDV. Trong các
hình trên ta thấy rằng chủng PEDV 0118 được biểu diễn bởi hình ngũ giác màu