Cĩ 2 loại phản ứng ELISA được sử dụng xác định kháng thể kháng PEDV,
bao gồm ELISA gián tiếp (Hofmann & Wyler, 1990; Joseph & cs., 2015; Okda & cs., 2015) và ELISA cạnh tranh (Okda & cs., 2015). ELISA gián tiếp được phát triển dựa trên kháng nguyên tồn phần của virus hoặc protein tái tổ hợp (protein S, N hoặc M). Protein N của PEDV là một nucleocapsid xoắn ốc với bộ
gen ARN, là vùng quyết định kháng nguyên quan trọng dùng nghiên cứu phát triển kháng nguyên chẩn đốn bằng ELISA.
ELISA cạnh tranh hay ELISA blocking được phát triển dựa vào kháng thể PEDV đơn dịng hoặc đa dịng đặc hiệu gắn đĩa phản ứng. Ưu điểm của phản ứng ELISA blocking làm tăng độ nhạy khi so sánh ELISA gián tiếp, tuy nhiên phản ứng ELISA blocking phụ thuộc loại kháng thể blocking (Ana & cs., 1995).
Hiện nay, phản ứng ELISA gián tiếp (iELISA) và ELISA blocking
(bELISA) dựa trên protein N cĩ giá trị dùng trong thí nghiệm và chẩn đốn lâm sàng với độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA gián tiếp là 97,9% và 97,6%, ELISA
blocking 98,2%và 98% (Okda & cs., 2015). Cả 2 phản ứng xác định được kháng thể IgG đặc hiệu protein N sau khi lợn nhiễm PEDV 9-14 ngày. Kháng thể cao nhất sau 21 ngày nhiễm PEDV và duy trì 43 ngày sau khi nhiễm.
Phản ứng ELISA gián tiếp hiện nay được phát triển để đánh giá sự xuất hiện kháng thể IgG và IgA đặc hiệu trong dịch đường tiêu hĩa, đặc biệt kháng thể IgA đặc hiệu ở đường tiêu hĩa dường như tăng 100 ngày sau khi nhiễm PEDV. Kết quả này là thơng tin để kiểm sốt sự phơi nhiễm PEDV trong đàn.
Một đánh giá trước đây về phản ứng chéo, thí nghiệm được thực hiện bởi kháng thể đơn dịng dùng cho phản ứng bELISA với tất cả các dịng PEDV, các dịng đồng chủng và dịng dị chủng (CV777, PC177, S INDEL) thì đều cĩ hiệu giá kháng thể giống nhau. Nhưng khơng cĩ phản ứng chéo giữa kháng thể đơn dịng kháng protein S của PEDV và TGEV (dịng Miller và dịng Purdue) (Lin & cs., 2015).
PHẦN 3. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
-Virus PED phân lập thực địa tại miền Bắc Việt Nam, đã phân lập trên mẫu
bệnh phẩm từnăm 2016 đến năm 2018; -Vắc xin PEDV đại diện PEDV thuộc genogroup G1 lấy trong tháng 06
năm 2019 tại thịtrường Việt Nam;
- Kháng thể trung hịa virus PED.
3.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
-Thời gian: Từ tháng 6/2019 đến tháng 6/2020;
-Địa điểm: Trung tâm kiểm nghiệm dược và sinh phẩm Cơng ty TNHH
Dược Hanvet-KCN Phố Nối A - Mỹ Hịa - Hưng Yên.
3.3. NGUYÊN LIỆU
3.3.1. Virus PED dùng trong nghiên cứu
-Virus PED phân lập thực địa dùng trong nghiên cứu là 4 mẫu PEDV phân lập từ bệnh phẩm của lợn con theo mẹ mắc tiêu chảy cấp, bệnh phẩm thu thập từ năm 2016 đến năm 2018 tại miền Bắc Việt Nam, do phịng thí nghiệm Cơng ty Hanvet cung cấp. Mỗi mẫu virus được chia nhỏ vào ống Eppendorf và bảo quản
ở -800C coi như là virus gốc cho việc nghiên cứu. Virus được giám định trong nội dung nghiên cứu.
-Vắc xin PED nhược độc nhập khẩu, lấy mẫu trên thị trường tháng 6 năm
2019. Thơng tin ghi trên nhãn sản phẩm: vắc xin nhược độc đơng khơ sản xuất
tháng 01 năm 2019, hạn dùng tháng 06 năm 2021, bảo quản 4-80C. Dịng virus vắc xin được nhìn nhận ban đầu thuộc PEDV genogroup 1b, được giám định genogroup trong nội dung nghiên cứu.
3.3.2. Hĩa chất, sinh phẩm trong nghiên cứu
-Huyết thanh lợn, sữa đầu lợn nái (huyết thanh lợn nái, huyết thanh lợn con theo mẹ) thu mẫu ở trại âm tính và dương tính PEDV là nguồn mẫu so sánh kết quả giữa 2 phương pháp ELISA và phản ứng trung hịa mới xây dựng (trại dương tính/âm tính được xác định bằng cách huyết thanh được làm ELISA, phân lợn con bị tiêu chảy được xác định RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu PEDV);
-Mẫu huyết thanh lợn tối miễn dịch kháng nguyên PEDV thực địa được tạo mẫu chuẩn dương phịng thí nghiệm gọi tắt mẫu chuẩn QC (+);
-Mẫu huyết thanh lợn khơng cĩ kháng thể kháng PEDV được xác định bằng ELISA và phản ứng trung hịa, gọi tắt mẫu chuẩn QC (-);
-Dịng tế bào Vero (ATCC - CCL-81);
-Mơi trường: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM- Gibco), huyết thanh bào thai bị (FBS-Gibco); Tryptose Phosphate Broth (TBP-Merck); Yeast extract (YE-Merck); Trypsin 1: 250 (Gibco);
-Sinh phẩm, hĩa chất dùng nhuộm IPMA: anti- PEDV monoclonal antibody (Median Diagnostics Inc), HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US Biological); N, N-Dimethylformamide (Sigma); cơ chất 3-amino-9- ethylcarbazole (AEC- Sigma);
-PBS 1x, pH 7,2;
-Kít tách ARN (Patho Gene-spin DNA/RNA extraction kit, iNtRON 17154); -Bộ kít tổng hợp cDNA (MMLV reverse transcriptase, Promega, M1705), kít PCR (GoTaq G2 Hot Start Master, Promega, M7423); các bộ mồi đặc hiệu
giám định genogroup PEDV, phát hiện TGEV, Rotavirus được lấy theo nghiên cứu trước đây (Song & cs., 2006; Zhao & cs., 2014);
-Nghiên cứu dùng đối chứng dương ARN- PEDV dùng trong phản ứng
RT- PCR: vắc xin PEDV nhược độc cơng ty Deasung Hàn Quốc;
-Vắc xin kép chứa TGEV và Rotavirus ProSystem 2143 (Intervet) làm đối
chứng dương ARN TGEV và Rotavirus;
-Thang ADN chuẩn:100 bp (hãng Cleverscientific), đối chứng dương
chuẩn của Rotavirus và TGEV (vắc xin Prosysterm, Merck Animal Health). -Bộ ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể PEDV (Swinecheck PED
indirect- TRM-558, Biovet);
-Bộ phản ứng ELISA (được thiết lập theo tiêu chuẩn cơ sở) phát hiện kháng thể kháng protein S của PEDV.
3.3.3. Vật tư và thiết bị
-Các loại chai T-flask, đĩa nuơi cấy tế bào 96 giếng (Corning cung cấp); -Các loại Pippete, các loại đầu cơn (Ependorf cung cấp);
-Tủ nuơi ấm 5% CO2 ;
-Máy PCR (Proflex PCR- Applied Biosysterms); -Bộđiện di và đọc kết quả PCR.
Hình 3.1. Hĩa chất, sinh phẩm nghiên cứu
Hình 3.2. Thiết bị và phịng thí nghiệm đạt chuẩn GLP 3.4. NỘI DUNG
3.4.1. Lựa chọn chủng PEDV dùngtrong nghiên cứu
-Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus; -Giám định tính thuần khiết của chủng PEDV;
-Xác định độc lực của chủng PEDV thực địa.
3.4.2. Kết quả thiết lập phản ứng trung hịa
-Kết quả tối ưu mơi trường dùng trong phản ứng trung hịa; -Tốiưu cách đánh giá kết quả của phản ứng trung hịa.
3.4.3. Xác định giá trị sử dụng phản ứng trung hịa
- Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu trên nền mẫu thực địa
- Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC
- Phản ứng trung hịa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu
3. 4.4. Đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa các chủng
-Chế huyết thanh thỏ kháng các chủng PEDV thực địa
-Đánh giá khả năng trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
+ Khả năng trung hịacác chủng virus của huyết thanh kháng PEDV 0118
+ Kết quả hiệu giá kháng thể trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp RT-PCR 3.5.1. Phương pháp RT-PCR
-Tách chiết ARN tổng số được bằng Patho Gene-spin DNA/RNA
extraction kit, iNtRON 17154, các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất;
- ARN sau khi tách chiết được tổng hợp cDNA bằng kít tổng hợp cDNA (Maxime™ RT PreMix (Random Primer), iNtRON, 25082);
-Phản ứng PCR sử dụng GoTaq® G2 Master Mixes (Promega, M7822), cặp mồi P1/P2 đặc hiệu gene S của PEDV, cặp mồi T1/T2 phát hiện TGEV và rot3/rot5 phát hiện Rotavirus, trình tự mồi được trình bảy Bảng 3.1. Đối chứng
dương là chủng TGEV và Rotavirus serotype A, vacxin ProSystem 2143
(Intervet) và các bước thực hiện theo phương pháp mơ tả trước đây (Song & cs., 2006; Sun & cs., 2014).
Bảng 3.1. Trình tự mồi của virus PEDV, TGEV, Rotavirus
TT Tên mồi Trình tự nucleotid 5’- 3’ phẩmSản Ghi chú
1 P1 TTCTGAGTCACGAACAGCCA 651bp Đặc hiệu PEDV P2 CATATGCAGCCTGCTCTGAA 2 T1 GTGGTTTTGGTYRTAAATGC 859bp Đặc hiệu TGEV T2 CACTAACCAACGTGGARCTA
3 rot3 AAAGATGCTAGGGACAAAATTG 309bp Đặc hiệu
Rotavirus A rot5 TTCAGATTGTGGAGCTATTCCA
- Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2%, điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Thời gian điện di trong 30 phút, kết thúc điện di, bản gel được nhuộm Red gel trong khoảng 5 - 6 phút. Sau khi nhuộm, bản gel được chuyển vào bộ phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí DNA được phát hiện là những vệt phát sáng. Kết quảdương tính khi mẫu cho kích thước sản phẩm DNA
theo đúng thiết kế mồi Bảng 3.1, mẫu âm tính khi khơng cĩ sản phẩm DNA- khơng cĩ vệt phát sáng.
3.5.2. Phương pháp giám định genogroup của PEDV
Để phân biệt PEDV dịng cổ điển (genogroup G1) và PEDV dịng mới nổi (genogroup G2) nghiên cứu xác định genogroup bằng phản ứng multiplex RT-
PCR. Cặp mồi sử dụng được chọn theo cơng bố trước đâyphương pháp (Zhao & cs., 2014) với trình tự được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu genogroup PEDV Tên mồi Trình tự nucleotide 5’- 3’
PED.Zhao.840F AACACTTAGCCTACCACAAGATG PED.Zhao.840R TGGCCTAGTCCATAAATCTTAGG
PED.F-Probe-V TGGTACTGTGCTGGCCAACATCCA PED.F-Probe-C AGCTGGTACTGTGGCACAGGCATTG
Bảng 3.3. Cách kết hợp mồi xác định genogroup PEDV
Mục đích Kết hợp mồi Kích thước sản phẩm
Đặc hiệu chung PEDV PED.Zhao.840F/
PED.Zhao.840R 817 bp
Đặc hiệu genogroup G1 PED.F-Probe-C/
PED.Zhao.840R 685 bp
Đặc hiệu genogroup G2 PED.F-Probe-V/
PED.Zhao.840R 669 bp
Cách đọc kết quả phản ứng multiplex RT-PCR như sau: cặp mồi PED.Zhao.840F/ PED.Zhao.840R chung cho genogroup G1 và genogroup G2, nên tất cả các mẫu dương tính PEDV thì đều cĩ băng sản phẩm cĩ kích thước 817bp. Nếu PEDV thuộc genogroup G1 sẽ cĩ thêm băng sản phẩm 685 bp
(PED.F-Probe-C/ PED.Zhao.840R). Nếu PEDV thuộc chủng genogroup G2 thì sẽ xuất hiện băng sản phẩm cĩ kích thước 669 bp (PED.F-Probe-V/ PED.Zhao.840R).
3.5.3. Phương pháp thử độclực của PEDV trên lợn con theo mẹ
Bố trí thí nghiệm để xác định độc lực của chủng PEDV 0118 đã chuyển 06 đời. Lợn con sơ sinh 1 ngày tuổi nuơi trong điều kiện khơng bú sữa mẹ, được nuơi bằng sữa chuyên dùng cho lợn con thiếu sữa mẹ (Nutrilac®- Joosten). Khi lợn 2 ngày tuổi, kiểm tra kháng thể PEDV trong huyết thanh bằng phản ứng Elisa, trung hịa và kiểm tra virus trong phân. Khi huyết thanh âm tính với kháng thể kháng PEDV và mẫu phân cho kết quả âm tính RT-PCR: PEDV, Rotavirus và TGEV thì
tiến hành xác định độc lực của chủng PEDV 0118, chia lợn làm 2 nhĩm:
-Nhĩm đối chứng 05 con: cho uống 5ml sữa/ con, khơng chứa virus;
-Nhĩm thí nghiệm 05 con: gây nhiễm bằng đường uống bởi 1ml hỗn dịch virus chứa 104.0 TCID50/ml trộn 5ml sữa.
Nuơi cách ly nghiêm ngặt ở 2 ơ chuồng khác nhau.Theo dõi lợn sau gây nhiễm các biểu hiện:
+ (1) Thể trạng lâm sàng: tình trạng tiêu chảy, nơn, mất nước, gầy, ăn uống, chết;
+ (2) Xét nghiệm virus thải trừ qua phân bằng RT-PCR;
+ (3) Mổ khám, quan sát bệnh tích: ruột, chất chứa trong ruột.
3.5.4. Phương pháp xác định hiệu giá PEDV trên tế bào Vero
- Chuẩn bị tế bào Vero 1 lớp nuơi 24 giờ trên đĩa 96 giếng trong mơi trường DMEM 5% FBS. Thảm tế bào được rửa 3 lần bằng PBS 1x.
- Hỗn dịch virus cần chuẩn độ được pha lỗng liên tiếp theo cơ số 10 trong
mơi trường DMEM bổ sung TBP 0,3%, YE 0,02% và trypsin 10µg/ml. Chuyển hỗn dịch virus ở mỗi độ pha lỗng vào 5 giếng tế bào, ủ đĩa 370C/ 5% CO2, ẩm, sau 24 giờ.
- Cố định tế bào vào đáy đĩa phản ứng bằng 50µl/giếng hỗn dịch PBS bố
sung NP40 1% và 10% formalin. Loại hỗn dịch cố định bằng cách rửa đĩa 3 lần bằng PBS 1x.
- Thêm kháng thể đặc hiệu kháng PEDV (Anti- PEDV monoclone
antibody) 50µl/giếng. Rửa đĩa bằng PBS 1x.
- Thêm 50µl/giếng kháng thể cộng hợp HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US Biological). Rửa đĩa bằng PBS 1x.
- Thêm 50µl/giếng cơ chất AEC, đánh giá phản ứng: quan sát qua kinh hiển vi soi ngược, nguyên sinh chất của tế bào bắt màu đỏ - dương tính, nguyên sinh chất khơng bắt màu- âm tính. Hiệu giá virus (TCID50 - liều nhiễm 50% số giếng tế bào) được tính theo cơng thức Spearman-Karber.
3.5.5. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PEDV
Để làm cơ sở tính độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa, nghiên cứu này chọn phản ứng ELISA (phát hiện kháng thể lớp IgG) làm tham chiếu. Kít ELISA đã thiết lập theo tiêu chuẩn cơ sở (ELISA cơ sở) được đánh giá độ nhạy/ đặc hiệu với kít ELISA thương mại SwinecheckPED indirect, Biovet
(khơng trình bày). Các bước thực hiện tĩm tắt như sau: chủng PEDV 0118 cường độc phủ đĩa ở hiệu giá 104,2 TCID50/ml trong coating buffer (pH = 9,6) ở 40C
trong 12 giờ; huyết thanh chẩn đốn được pha 1/200 trong sữa tách bơ 3% - PBS-
Tween 20 0,05%; kháng thể kháng IgG lợn gắn enzyme được pha 1/1200 trong sữa tách bơ 3%- PBS- Tween 20 0,05%. Giữa các bước, ủ ở nhiệt độ 370C, trong
vịng 60 phút; rửa 3 lần bằng dung dịch PBS- Tween 20 0,05% để loại bỏ các thành phần khơng đặc hiệu. Mẫu cĩ giá trị ngưỡng OD450 < 0,225 được xác định âm tính với kháng thể kháng PEDV.
3.5.6. Phương pháp miễn dịch mỗi chủng PEDV trên thỏ
-Chọn thỏ thí nghiệm: thỏ khỏe mạnh, 3 tháng tuổi, nặng từ 1,6 đến 2kg. Lấy máu trước tiêm kiểm tra kháng thể trung hịa PEDV cho kết quả âm tính;
- Bố trí nhĩm thỏ thí nghiệm: 1 chủng virus được miễn dịch trên 3 thỏ;
-Nhĩm đối chứng khơng tiêm. Các nhĩm thỏ được nuơi cách ly;
-Virus chủng PED được cơ đặc bằng PEG 6000, kiểm tra hiệu giá virus mỗi chủng PEDV. Định liều miễn dịch của các chủng PEDV 105,5 TCID50/ml
trước khi vơ hoạt bằng BEI (Banary ethyleneimine). Sau đĩ, gây nhũ bằng bổ trợ ISA 201 (Seppic) tạo hỗn dịch vắc xin dạng nhũ dầu;.
-Miễn dịch thỏ, miễn dịch 3 mũi/1 chủng PEDV với liều tăng dần theo trình tự: 1ml/con, 2ml/con, 4ml/con, tiêm dưới da, mỗi mũi cách nhau 7 ngày;
- Lấy máu khảo sát kháng thể trung hịa PEDV định kỳ, D0, D7, D14, D21,
D28, D35, D42. Thu hoạch máu thỏ tại D42 bằng đường động mạchcổ;
-Máu thỏ để đơng tự nhiên, chắt huyết thanh, vơ hoạt ở nhiệt độ 560C/30
Huyết thanh mỗi nhĩm thỏ được coi như huyết thanh chuẩn phịng thí nghiệm kháng mỗi chủng PEDV dùng nghiên cứu.
3.5.7. Phương pháp thiết lập phản ứng trung hịa PEDV
Phương pháp trung hịa virus được thiết lập với sự điều chỉnh từ các tài liệu đã mơ tả trước đây (Paudel & cs., 2014a; Collin & cs., 2015; Clement & cs., 2016). Phản ứng được thiết lập dựa trên loạt huyết thanh lợn dương tính và huyết thanh âm tính với kháng thể kháng PEDV. Các mẫu này được chọn từ bộ huyết thanh theo tiêu chuẩn cơ sở. Cụ thể, huyết thanh được thu thập ở lợn từ 2 trang trại: một trang trại lợn khơng cĩ tiền sử bệnh tiêu chảy do virus, xét nghiệm virus học âm tính với PEDV; trang trại cịn lại đã từng mắc PED, cĩ kết quả xét nghiệm dương tính với PEDV bằng phương pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu được tả trước đây (Song & cs., 2006). Mẫu huyết thanh được bất hoạt ở 560C/ 30
phút và khẳng định chắc chắn dương tính hoặc âm tính kháng thể kháng PEDV bằng phản ứng ELISA cơ sở.
Huyết thanh cần xác định hiệu giá kháng thể trung hịa được pha lỗng liên tiếp theo cơ số 2. Mỗi độ pha lỗng được trộn với thể tích virus cố định (hiệu giá
100 TCID50/100µl) theo tỷ lệ 1:1. Ủ huyễn dịch huyết thanh: virus ở 370C/ 5% CO2 trong vịng 1 giờ 30 phút. Chuyển 100 µl hỗn dịch huyết thanh: virus vào tế bào Vero 1 lớp (đã được rửa 3 lần bằng PBS-1X). Sau thời gian hấp phụ 1 giờ 30 phút, hút bỏ dịch huyễn dịch, rửa tế bào 3 lần và thêm 100µl DMEM duy trì cĩ
TPB (0,3%), YE (0,02%) và trypsin (8 µg/ml).
Xác định giếng cĩ kháng thể trung hịa dương tính bằng phương pháp hĩa miễn dịch, phản ứng miễn dịch trên tế bào một lớp, cố định thảm tế bào bằng dung dịch PBS chứa 10% formalin và 1% NP40, sau đĩ thêm kháng thể đặc hiệu
PEDV (anti- PEDV monoclonal antibody -MedianDiagnostics Inc.), rửa đĩa