-Các loại chai T-flask, đĩa nuơi cấy tế bào 96 giếng (Corning cung cấp); -Các loại Pippete, các loại đầu cơn (Ependorf cung cấp);
-Tủ nuơi ấm 5% CO2 ;
-Máy PCR (Proflex PCR- Applied Biosysterms); -Bộđiện di và đọc kết quả PCR.
Hình 3.1. Hĩa chất, sinh phẩm nghiên cứu
Hình 3.2. Thiết bị và phịng thí nghiệm đạt chuẩn GLP 3.4. NỘI DUNG
3.4.1. Lựa chọn chủng PEDV dùngtrong nghiên cứu
-Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus; -Giám định tính thuần khiết của chủng PEDV;
-Xác định độc lực của chủng PEDV thực địa.
3.4.2. Kết quả thiết lập phản ứng trung hịa
-Kết quả tối ưu mơi trường dùng trong phản ứng trung hịa; -Tốiưu cách đánh giá kết quả của phản ứng trung hịa.
3.4.3. Xác định giá trị sử dụng phản ứng trung hịa
- Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu trên nền mẫu thực địa
- Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC
- Phản ứng trung hịa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu
3. 4.4. Đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa các chủng
-Chế huyết thanh thỏ kháng các chủng PEDV thực địa
-Đánh giá khả năng trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
+ Khả năng trung hịacác chủng virus của huyết thanh kháng PEDV 0118
+ Kết quả hiệu giá kháng thể trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp RT-PCR 3.5.1. Phương pháp RT-PCR
-Tách chiết ARN tổng số được bằng Patho Gene-spin DNA/RNA
extraction kit, iNtRON 17154, các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất;
- ARN sau khi tách chiết được tổng hợp cDNA bằng kít tổng hợp cDNA (Maxime™ RT PreMix (Random Primer), iNtRON, 25082);
-Phản ứng PCR sử dụng GoTaq® G2 Master Mixes (Promega, M7822), cặp mồi P1/P2 đặc hiệu gene S của PEDV, cặp mồi T1/T2 phát hiện TGEV và rot3/rot5 phát hiện Rotavirus, trình tự mồi được trình bảy Bảng 3.1. Đối chứng
dương là chủng TGEV và Rotavirus serotype A, vacxin ProSystem 2143
(Intervet) và các bước thực hiện theo phương pháp mơ tả trước đây (Song & cs., 2006; Sun & cs., 2014).
Bảng 3.1. Trình tự mồi của virus PEDV, TGEV, Rotavirus
TT Tên mồi Trình tự nucleotid 5’- 3’ phẩmSản Ghi chú
1 P1 TTCTGAGTCACGAACAGCCA 651bp Đặc hiệu PEDV P2 CATATGCAGCCTGCTCTGAA 2 T1 GTGGTTTTGGTYRTAAATGC 859bp Đặc hiệu TGEV T2 CACTAACCAACGTGGARCTA
3 rot3 AAAGATGCTAGGGACAAAATTG 309bp Đặc hiệu
Rotavirus A rot5 TTCAGATTGTGGAGCTATTCCA
- Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2%, điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Thời gian điện di trong 30 phút, kết thúc điện di, bản gel được nhuộm Red gel trong khoảng 5 - 6 phút. Sau khi nhuộm, bản gel được chuyển vào bộ phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí DNA được phát hiện là những vệt phát sáng. Kết quảdương tính khi mẫu cho kích thước sản phẩm DNA
theo đúng thiết kế mồi Bảng 3.1, mẫu âm tính khi khơng cĩ sản phẩm DNA- khơng cĩ vệt phát sáng.
3.5.2. Phương pháp giám định genogroup của PEDV
Để phân biệt PEDV dịng cổ điển (genogroup G1) và PEDV dịng mới nổi (genogroup G2) nghiên cứu xác định genogroup bằng phản ứng multiplex RT-
PCR. Cặp mồi sử dụng được chọn theo cơng bố trước đâyphương pháp (Zhao & cs., 2014) với trình tự được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu genogroup PEDV Tên mồi Trình tự nucleotide 5’- 3’
PED.Zhao.840F AACACTTAGCCTACCACAAGATG PED.Zhao.840R TGGCCTAGTCCATAAATCTTAGG
PED.F-Probe-V TGGTACTGTGCTGGCCAACATCCA PED.F-Probe-C AGCTGGTACTGTGGCACAGGCATTG
Bảng 3.3. Cách kết hợp mồi xác định genogroup PEDV
Mục đích Kết hợp mồi Kích thước sản phẩm
Đặc hiệu chung PEDV PED.Zhao.840F/
PED.Zhao.840R 817 bp
Đặc hiệu genogroup G1 PED.F-Probe-C/
PED.Zhao.840R 685 bp
Đặc hiệu genogroup G2 PED.F-Probe-V/
PED.Zhao.840R 669 bp
Cách đọc kết quả phản ứng multiplex RT-PCR như sau: cặp mồi PED.Zhao.840F/ PED.Zhao.840R chung cho genogroup G1 và genogroup G2, nên tất cả các mẫu dương tính PEDV thì đều cĩ băng sản phẩm cĩ kích thước 817bp. Nếu PEDV thuộc genogroup G1 sẽ cĩ thêm băng sản phẩm 685 bp
(PED.F-Probe-C/ PED.Zhao.840R). Nếu PEDV thuộc chủng genogroup G2 thì sẽ xuất hiện băng sản phẩm cĩ kích thước 669 bp (PED.F-Probe-V/ PED.Zhao.840R).
3.5.3. Phương pháp thử độclực của PEDV trên lợn con theo mẹ
Bố trí thí nghiệm để xác định độc lực của chủng PEDV 0118 đã chuyển 06 đời. Lợn con sơ sinh 1 ngày tuổi nuơi trong điều kiện khơng bú sữa mẹ, được nuơi bằng sữa chuyên dùng cho lợn con thiếu sữa mẹ (Nutrilac®- Joosten). Khi lợn 2 ngày tuổi, kiểm tra kháng thể PEDV trong huyết thanh bằng phản ứng Elisa, trung hịa và kiểm tra virus trong phân. Khi huyết thanh âm tính với kháng thể kháng PEDV và mẫu phân cho kết quả âm tính RT-PCR: PEDV, Rotavirus và TGEV thì
tiến hành xác định độc lực của chủng PEDV 0118, chia lợn làm 2 nhĩm:
-Nhĩm đối chứng 05 con: cho uống 5ml sữa/ con, khơng chứa virus;
-Nhĩm thí nghiệm 05 con: gây nhiễm bằng đường uống bởi 1ml hỗn dịch virus chứa 104.0 TCID50/ml trộn 5ml sữa.
Nuơi cách ly nghiêm ngặt ở 2 ơ chuồng khác nhau.Theo dõi lợn sau gây nhiễm các biểu hiện:
+ (1) Thể trạng lâm sàng: tình trạng tiêu chảy, nơn, mất nước, gầy, ăn uống, chết;
+ (2) Xét nghiệm virus thải trừ qua phân bằng RT-PCR;
+ (3) Mổ khám, quan sát bệnh tích: ruột, chất chứa trong ruột.
3.5.4. Phương pháp xác định hiệu giá PEDV trên tế bào Vero
- Chuẩn bị tế bào Vero 1 lớp nuơi 24 giờ trên đĩa 96 giếng trong mơi trường DMEM 5% FBS. Thảm tế bào được rửa 3 lần bằng PBS 1x.
- Hỗn dịch virus cần chuẩn độ được pha lỗng liên tiếp theo cơ số 10 trong
mơi trường DMEM bổ sung TBP 0,3%, YE 0,02% và trypsin 10µg/ml. Chuyển hỗn dịch virus ở mỗi độ pha lỗng vào 5 giếng tế bào, ủ đĩa 370C/ 5% CO2, ẩm, sau 24 giờ.
- Cố định tế bào vào đáy đĩa phản ứng bằng 50µl/giếng hỗn dịch PBS bố
sung NP40 1% và 10% formalin. Loại hỗn dịch cố định bằng cách rửa đĩa 3 lần bằng PBS 1x.
- Thêm kháng thể đặc hiệu kháng PEDV (Anti- PEDV monoclone
antibody) 50µl/giếng. Rửa đĩa bằng PBS 1x.
- Thêm 50µl/giếng kháng thể cộng hợp HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US Biological). Rửa đĩa bằng PBS 1x.
- Thêm 50µl/giếng cơ chất AEC, đánh giá phản ứng: quan sát qua kinh hiển vi soi ngược, nguyên sinh chất của tế bào bắt màu đỏ - dương tính, nguyên sinh chất khơng bắt màu- âm tính. Hiệu giá virus (TCID50 - liều nhiễm 50% số giếng tế bào) được tính theo cơng thức Spearman-Karber.
3.5.5. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PEDV
Để làm cơ sở tính độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa, nghiên cứu này chọn phản ứng ELISA (phát hiện kháng thể lớp IgG) làm tham chiếu. Kít ELISA đã thiết lập theo tiêu chuẩn cơ sở (ELISA cơ sở) được đánh giá độ nhạy/ đặc hiệu với kít ELISA thương mại SwinecheckPED indirect, Biovet
(khơng trình bày). Các bước thực hiện tĩm tắt như sau: chủng PEDV 0118 cường độc phủ đĩa ở hiệu giá 104,2 TCID50/ml trong coating buffer (pH = 9,6) ở 40C
trong 12 giờ; huyết thanh chẩn đốn được pha 1/200 trong sữa tách bơ 3% - PBS-
Tween 20 0,05%; kháng thể kháng IgG lợn gắn enzyme được pha 1/1200 trong sữa tách bơ 3%- PBS- Tween 20 0,05%. Giữa các bước, ủ ở nhiệt độ 370C, trong
vịng 60 phút; rửa 3 lần bằng dung dịch PBS- Tween 20 0,05% để loại bỏ các thành phần khơng đặc hiệu. Mẫu cĩ giá trị ngưỡng OD450 < 0,225 được xác định âm tính với kháng thể kháng PEDV.
3.5.6. Phương pháp miễn dịch mỗi chủng PEDV trên thỏ
-Chọn thỏ thí nghiệm: thỏ khỏe mạnh, 3 tháng tuổi, nặng từ 1,6 đến 2kg. Lấy máu trước tiêm kiểm tra kháng thể trung hịa PEDV cho kết quả âm tính;
- Bố trí nhĩm thỏ thí nghiệm: 1 chủng virus được miễn dịch trên 3 thỏ;
-Nhĩm đối chứng khơng tiêm. Các nhĩm thỏ được nuơi cách ly;
-Virus chủng PED được cơ đặc bằng PEG 6000, kiểm tra hiệu giá virus mỗi chủng PEDV. Định liều miễn dịch của các chủng PEDV 105,5 TCID50/ml
trước khi vơ hoạt bằng BEI (Banary ethyleneimine). Sau đĩ, gây nhũ bằng bổ trợ ISA 201 (Seppic) tạo hỗn dịch vắc xin dạng nhũ dầu;.
-Miễn dịch thỏ, miễn dịch 3 mũi/1 chủng PEDV với liều tăng dần theo trình tự: 1ml/con, 2ml/con, 4ml/con, tiêm dưới da, mỗi mũi cách nhau 7 ngày;
- Lấy máu khảo sát kháng thể trung hịa PEDV định kỳ, D0, D7, D14, D21,
D28, D35, D42. Thu hoạch máu thỏ tại D42 bằng đường động mạchcổ;
-Máu thỏ để đơng tự nhiên, chắt huyết thanh, vơ hoạt ở nhiệt độ 560C/30
Huyết thanh mỗi nhĩm thỏ được coi như huyết thanh chuẩn phịng thí nghiệm kháng mỗi chủng PEDV dùng nghiên cứu.
3.5.7. Phương pháp thiết lập phản ứng trung hịa PEDV
Phương pháp trung hịa virus được thiết lập với sự điều chỉnh từ các tài liệu đã mơ tả trước đây (Paudel & cs., 2014a; Collin & cs., 2015; Clement & cs., 2016). Phản ứng được thiết lập dựa trên loạt huyết thanh lợn dương tính và huyết thanh âm tính với kháng thể kháng PEDV. Các mẫu này được chọn từ bộ huyết thanh theo tiêu chuẩn cơ sở. Cụ thể, huyết thanh được thu thập ở lợn từ 2 trang trại: một trang trại lợn khơng cĩ tiền sử bệnh tiêu chảy do virus, xét nghiệm virus học âm tính với PEDV; trang trại cịn lại đã từng mắc PED, cĩ kết quả xét nghiệm dương tính với PEDV bằng phương pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu được tả trước đây (Song & cs., 2006). Mẫu huyết thanh được bất hoạt ở 560C/ 30
phút và khẳng định chắc chắn dương tính hoặc âm tính kháng thể kháng PEDV bằng phản ứng ELISA cơ sở.
Huyết thanh cần xác định hiệu giá kháng thể trung hịa được pha lỗng liên tiếp theo cơ số 2. Mỗi độ pha lỗng được trộn với thể tích virus cố định (hiệu giá
100 TCID50/100µl) theo tỷ lệ 1:1. Ủ huyễn dịch huyết thanh: virus ở 370C/ 5% CO2 trong vịng 1 giờ 30 phút. Chuyển 100 µl hỗn dịch huyết thanh: virus vào tế bào Vero 1 lớp (đã được rửa 3 lần bằng PBS-1X). Sau thời gian hấp phụ 1 giờ 30 phút, hút bỏ dịch huyễn dịch, rửa tế bào 3 lần và thêm 100µl DMEM duy trì cĩ
TPB (0,3%), YE (0,02%) và trypsin (8 µg/ml).
Xác định giếng cĩ kháng thể trung hịa dương tính bằng phương pháp hĩa miễn dịch, phản ứng miễn dịch trên tế bào một lớp, cố định thảm tế bào bằng dung dịch PBS chứa 10% formalin và 1% NP40, sau đĩ thêm kháng thể đặc hiệu
PEDV (anti- PEDV monoclonal antibody -MedianDiagnostics Inc.), rửa đĩa phản ứng, thêm kháng thể cộng hợp (HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US
Biological), thêm cơ chất AEC. Tế bào nhiễm virus đặc hiệu khi quan sát qua kính hiển vi soi ngược nguyên sinh chất của tế bào bắt màu đỏ của cơ chất AEC.
Đọc kết quả trung hịa theo mơ tả trước đây (Paudel & cs., 2014b), dựa vào mức độ giảm 90% số tế bào/ số cụm tế bào nhiễm virus so với đối chứng âm. Hiệu giá kháng thể trung hịa là số nghịch đảo của độ pha lỗng cao nhất mà ở ở độ pha lỗng đĩ dương tính. Mẫu được coi dương tính khi hiệu giá kháng thể trung hịa ≥ 8 (Qi & cs., 2016). Nhưng báo cáo khác thấy rằng 90% số lợn nghiên cứu cĩ hiệu giá kháng thể trung hịa ≥ 20, nên ngưỡng dương được xác định hiệu giá kháng thể ≥ 20 (Collin & cs., 2015; Qi & cs., 2016).
3.5.8. Đánh giá độ nhạy, độđặc hiệu của phản ứng trung hịa virus
Phản ứng ELISA được dùng làm tiêu chuẩn để đối chiếu kết quả của phương pháp trung hịa virus được thiết lập.Cụ thể, mỗi mẫu huyết thanh sẽ được phân tích lần lượt bằng phản ứng ELISA cơ sở và phản ứng trung hịa virus. Mối tương quan giữa giá trị OD450 của ELISA cơ sở và hiệu giá trung hịa được xác định bằng giá trị R (Pearson Correlation Coefficient), tính theo dẫn liệu từ nguồn:
https://www.socscistatistics.com/tests/pearson/default2.aspx.
Cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp được trình bày Bảng 3.2.
Bảng 3.4. Cách tính độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp như sau Kết quả của phản ứng
trung hịa PEDV
Kết quả ELISA cơ sở
Số mẫu dương tính Số mẫu âm Số mẫu dương tính Kết quả (+) : kí hiệu TP Kết quả (+) : ký hiệu FP
Số mẫu âm tính Kết quả (-) : kí hiệu FN Kết quả (-) : kí hiệu TN
Ghi chú: TP: true positive dương đúng, FP: fall positive- dương sai, TN: true negative- âm đúng, FN: fall negative âm sai; sensitivity- nhạy,, Specificity- đặc hiệu.
- Độ nhạy (Sensitivity positive): SP ( = TP/(TP+FN) × 100 (phát hiện đúng khi cĩ kháng thể);
-Độ đặc hiệu (Sensitivity negative): SN=TN/(TN+FP) × 100 (khơng phát hiện khi khơng cĩ kháng thể).
3.5.9. Phương pháp phản ứng trung hịa chéo giữa các chủng virus
Sau khi sản xuất huyết thanh thỏ kháng mỗi chủng PEDV tiến hành phản ứng trung hịa, mỗi kháng huyết thanh phản ứng với mỗi chủng PEDV.
So sánh miễn dịch chéo là so sánh cặp đơi giữa kháng huyết thanh miễn dịch một PEDV phản ứng từng cặp một với virus đồng chủng và virus dị chủng, sự tương quan hiệu giá kháng thể được tính tốn bởi tỉ số r (Ratio serological
relatedness) (Rweyemamu, 1978).
r =
Hiệu giá kháng thể trung hịa virus dị chủng Hiệu giá kháng thể trung hịa virus đồng chủng
Huyết thanh pha lỗng cơ số 2 đảm bảo mỗi nồng độ đủ thể tích và đồng nhất phân chia đủ vào mỗi giếng trung hịa với các chủng PEDV. Mỗi chủng
PEDV cố định 1 nồng độ dự kiến 100 TCID50/100µl, đảm bảo đồng nhất để phân chia đủ với mỗi nồng độ huyết thanh kháng mỗi chủng. Yêu cầu phản ứng trung hịa giữa huyết thanh kháng đồng chủng và kháng dị chủng phải diễn ra trong cùng thời gian, cùng lơ tế bào phản ứng, cùng lơ mơi trường duy trì, được thực hiện bởi kỹ thuật viên cĩ kinh nghiệm. Phương pháp làm phản ứng trung hịa
tương tự như phần 3.5.7.
Sau khi đánh giá kháng thể trung hịa của mỗi kháng huyết thanh thỏ thì được tính tốn giá trị tương quan giữa các cặp đơi bằng tỉ số (ratio) như sau:
r1=
Hiệu giá kháng thể VNT của huyết thanh thỏ phản ứng PEDV dị chủng Hiệu giá kháng thể VNT của huyết thanh thỏ phản ứng PEDV đồng chủng So sánh các giá trị r1, từ đĩ cĩ nhận xét khả năng miễn dịch và kháng chéo với mỗi chủng PEDV nghiên cứu.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. LỰA CHỌN CHỦNG PEDV DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
4.1.1. Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus
Bốn chủng virus PED phân lập tại thực địa từ mẫu bệnh phẩm thu thập năm 2016 đến năm 2018 tại miền Bắc Việt Nam, nhĩm nghiên cứu của cơng ty Hanvet phân lập trên tế bào Vero trong năm 2018 đến đầu năm 2019. Tiếp nhận mẫu virus chúng tơi xác định hiệu giá virus mỗi chủng ở đời P4 và đời P6, kết quả được trình bày ở Bảng 4.1. Ký hiệu 4 chủng PEDV dưới đây được viết bằng chữ PEDV và 4 chữ số: 2 số đầu là thứ tựmẫu bệnh phẩm thu thập/ năm và 2 số tiếp theo là2 số cuối của năm thu mẫu.
Để đánh giá hàm lượng virus PED thực địa, trypsin là thành phần khơng thể thiếu trong mơi trường duy trì chuẩn độ, nhưngtrypsin cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự co và bong của tế bào (Hofmann & cs., 1988). Ngồi ra, hàm lượng virus
thấp, ở nồng độ pha lỗng cuối CPE biểu hiện khơng rõ ràng. Do đĩ để đọc được kết quả chuẩn độ PEDV thực địa thì nhuộm hĩa miễn dịch (IPMA) là giải pháp tối ưu, Hình 4.1 ghi nhận bệnh tích tế bào của mỗi chủng PEDV ở đời P6 với nồng độ pha lỗng 10-3 sau 24 giờ chuẩn độ.
Ghi chú: Bệnh tích tế bào (CPE) được biểu hiện qua phản ứng nhuộm hĩa miễn dịch, đối chứng dương (+) là PEDV nhược độc từ vắc xin.
Hình ảnh trên cho thấy, bệnh tích tế bào (CPE) của các chủng PEDV phân lập biểu hiện ở đời cấy chuyển thứ 6 (P6) nồng độ pha lỗng virus 10-3. Kháng