PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. LỰA CHỌN CHỦNG PEDV DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
4.1.1. Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus
Bốn chủng virus PED phân lập tại thực địa từ mẫu bệnh phẩm thu thập năm 2016 đến năm 2018 tại miền Bắc Việt Nam, nhĩm nghiên cứu của cơng ty Hanvet phân lập trên tế bào Vero trong năm 2018 đến đầu năm 2019. Tiếp nhận mẫu virus chúng tơi xác định hiệu giá virus mỗi chủng ở đời P4 và đời P6, kết quả được trình bày ở Bảng 4.1. Ký hiệu 4 chủng PEDV dưới đây được viết bằng chữ PEDV và 4 chữ số: 2 số đầu là thứ tựmẫu bệnh phẩm thu thập/ năm và 2 số tiếp theo là2 số cuối của năm thu mẫu.
Để đánh giá hàm lượng virus PED thực địa, trypsin là thành phần khơng thể thiếu trong mơi trường duy trì chuẩn độ, nhưngtrypsin cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự co và bong của tế bào (Hofmann & cs., 1988). Ngồi ra, hàm lượng virus
thấp, ở nồng độ pha lỗng cuối CPE biểu hiện khơng rõ ràng. Do đĩ để đọc được kết quả chuẩn độ PEDV thực địa thì nhuộm hĩa miễn dịch (IPMA) là giải pháp tối ưu, Hình 4.1 ghi nhận bệnh tích tế bào của mỗi chủng PEDV ở đời P6 với nồng độ pha lỗng 10-3 sau 24 giờ chuẩn độ.
Ghi chú: Bệnh tích tế bào (CPE) được biểu hiện qua phản ứng nhuộm hĩa miễn dịch, đối chứng dương (+) là PEDV nhược độc từ vắc xin.
Hình ảnh trên cho thấy, bệnh tích tế bào (CPE) của các chủng PEDV phân lập biểu hiện ở đời cấy chuyển thứ 6 (P6) nồng độ pha lỗng virus 10-3. Kháng
nguyên virus được quan sát rõ ràng bởi virus khu trú trong nguyên sinh chất của tế bào và bắt màu đỏ của cơ chất AEC. Đáng lưu ý, các tế bào nhiễm virus đơn lẻ chiếm đa số, tế bào đa nhân - thể hợp bào ít ở đời cấy chuyển thấp (P6). Khơng cĩ sự khác biệt về hình ảnh tế bào nhiễm virus giữa các chủng PEDV phân lập thực địa. Tuy nhiên cĩ sự khác biệt khi so sánh bệnh tích tế bào với chủng virus
nhược độc (đối chứng dương). Bệnh tích tế bào của virus nhược độc xuất hiện các cụm tế bào đa nhân, thể hợp bào hàng trăm nhân chiếm đa số, chúng phát triển tạo thành vịng trịn khép kín. Trong nghiên cứu này, biều hiện bệnh tích PEDV thực địa phù hợp với mổ tả trước đây của nhĩm tác giả (Hofmann & Wyler, 1988): sau 24 giờ gây nhiễm virus trên tế bào Vero, tế bào được nhuộm miễn dịch huỳnh quang, protein đặc hiệu của PEDV trong nguyên sinh chất của tế bào, ở các đời phân lập PEDV đầu tiên xuất hiện các tế bào đơn lẻ nhiễm virus hoặc cụm đa nhân (10 nhân) cĩ nguyên sinh chất phát quang, sau khi cấy chuyển thích nghi thể hợp bào chứa hàng trămnhân sẽ chiếm ưu thế.
Bảng 4.1. Hiệu giá bốnchủng PEDV phân lập thực địa
TT Ký hiệu chủng virus phân lập được Năm thu mẫu bệnh phẩm Địa điểm
Hiệu giá virus (log10 TCID50/ml)
Đời virus P4 Đời virus P6
1 PEDV 0116 2016 Hải Dương 4,3 5,7
2 PEDV 0117 2017 Hưng Yên 4,5 5,9
3 PEDV 0317 2017 Hà Nam 4,5 5,7
4 PEDV 0118 2018 Hưng Yên 4,7 6,1 Kết quả trên cho thấy, khảo sát hiệu giá virus ở đời P4 và đời P6 cả bốn chủng PEDV hiệu giá virus đều tăng sau khi tiếp đời, điều đĩ cho biết virus đang
thích nghi trên tế bào Vero. Bằng phản ứng nhuộm miễn dịch gắn enzym peroxidase (IPMA) xác định được virus cĩ mặt trong tế bào ở mỗi giếng chuẩn độ. Hiệu giá virus cao nhất đạt được 106,1 TCID50/ml với chủng PEDV 0118 P6.
Tham khảo một số báo cáo trước đây, nhĩm tác giả (Nguyễn Thị Hoa & cs.,
2018) phân lập PEDV sau 4 đời cấy chuyển một số chủng đã đạt được hiệu giá
107,3TCID50/ml. Tuy nhiên, theo nhĩm tác giả (Kusanagi & cs., 1992) cho biết cấy chuyển mù một số đời sau đĩ xác nhận sự cĩ mặt của PEDV trong tế bào. Bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang, kết quả hiệu giá đạt được 105,5
TCID50/ml. Chúng tơi nhận định rằng, sự chênh hiệu giá virus mỗi phịng thí nghiệm cĩ thể xảy ra bởi độ nhạy phương pháp đánh giá hoặc do chủng virus cĩ sự thích nghi khác nhau.
Kết quả nghiên cứu đã xác định được hiệu giá virus bằng phương pháp nhuộm hĩa miễn dịch, kết quả được sử dụng để định liều virus trong phản ứng trung hịa với liều virus phản ứng 100TCID50/100µl. Thêm vào đĩ hình ảnh CPE được bộc lộ rõ qua phản ứng IPMA khơng những là để đánh giá chính xác phản ứng chuẩn độ virus mà cịn là cách để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hịa ở nội dung tiếp theo.