PHẦN 3 NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.7. Phương pháp thiết lập phản ứng trung hịa PEDV
Phương pháp trung hịa virus được thiết lập với sự điều chỉnh từ các tài liệu đã mơ tả trước đây (Paudel & cs., 2014a; Collin & cs., 2015; Clement & cs., 2016). Phản ứng được thiết lập dựa trên loạt huyết thanh lợn dương tính và huyết thanh âm tính với kháng thể kháng PEDV. Các mẫu này được chọn từ bộ huyết thanh theo tiêu chuẩn cơ sở. Cụ thể, huyết thanh được thu thập ở lợn từ 2 trang trại: một trang trại lợn khơng cĩ tiền sử bệnh tiêu chảy do virus, xét nghiệm virus học âm tính với PEDV; trang trại cịn lại đã từng mắc PED, cĩ kết quả xét nghiệm dương tính với PEDV bằng phương pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu được tả trước đây (Song & cs., 2006). Mẫu huyết thanh được bất hoạt ở 560C/ 30
phút và khẳng định chắc chắn dương tính hoặc âm tính kháng thể kháng PEDV bằng phản ứng ELISA cơ sở.
Huyết thanh cần xác định hiệu giá kháng thể trung hịa được pha lỗng liên tiếp theo cơ số 2. Mỗi độ pha lỗng được trộn với thể tích virus cố định (hiệu giá
100 TCID50/100µl) theo tỷ lệ 1:1. Ủ huyễn dịch huyết thanh: virus ở 370C/ 5% CO2 trong vịng 1 giờ 30 phút. Chuyển 100 µl hỗn dịch huyết thanh: virus vào tế bào Vero 1 lớp (đã được rửa 3 lần bằng PBS-1X). Sau thời gian hấp phụ 1 giờ 30 phút, hút bỏ dịch huyễn dịch, rửa tế bào 3 lần và thêm 100µl DMEM duy trì cĩ
TPB (0,3%), YE (0,02%) và trypsin (8 µg/ml).
Xác định giếng cĩ kháng thể trung hịa dương tính bằng phương pháp hĩa miễn dịch, phản ứng miễn dịch trên tế bào một lớp, cố định thảm tế bào bằng dung dịch PBS chứa 10% formalin và 1% NP40, sau đĩ thêm kháng thể đặc hiệu
PEDV (anti- PEDV monoclonal antibody -MedianDiagnostics Inc.), rửa đĩa phản ứng, thêm kháng thể cộng hợp (HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US
Biological), thêm cơ chất AEC. Tế bào nhiễm virus đặc hiệu khi quan sát qua kính hiển vi soi ngược nguyên sinh chất của tế bào bắt màu đỏ của cơ chất AEC.
Đọc kết quả trung hịa theo mơ tả trước đây (Paudel & cs., 2014b), dựa vào mức độ giảm 90% số tế bào/ số cụm tế bào nhiễm virus so với đối chứng âm. Hiệu giá kháng thể trung hịa là số nghịch đảo của độ pha lỗng cao nhất mà ở ở độ pha lỗng đĩ dương tính. Mẫu được coi dương tính khi hiệu giá kháng thể trung hịa ≥ 8 (Qi & cs., 2016). Nhưng báo cáo khác thấy rằng 90% số lợn nghiên cứu cĩ hiệu giá kháng thể trung hịa ≥ 20, nên ngưỡng dương được xác định hiệu giá kháng thể ≥ 20 (Collin & cs., 2015; Qi & cs., 2016).