CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.11. Chuyển gen vào thực vật thông qua A.tumefaciens
Quy trình thực hiện:
1 Tạo dịch huyền phù: Cấy khuẩn lạc vi khuẩn A. tumefaciens chứa plasmid quan tâm trong môi trường LB đặc sang môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp và lắc ở 200 vòng/phút, 28oC, tiến hành nuôi qua đêm. Sau 8 - 12 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn bằng môi trường lây nhiễm có bổ sung AS. Pha loãng dịch khuẩn cho tới khi đạt được OD600: 0.5-1.0. Dịch huyền phù vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm với phôi non của ngô. 2 Lây nhiễm vi khuẩn với phôi: Bắp ngô non được thu từ các cây ngô mẹ trồng
ngoài đồng ruộng từ 10 đến 12 ngày. Ngay sau khi thu hái, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng và được lây nhiễm với dịch vi khuẩn có bổ sung AS nồng độ 100 µM trong 20 phút.
3 Đồng nuôi cấy: Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 21oC trong 3 ngày.
4 Nuôi phục hồi: Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường đồng nuôi cấy sang môi trường phục hồi, nuôi trong tối ở 28oC, trong 7 ngày.
5 Chọn lọc mô sẹo: Mô sẹo tạo thành từ phôi non được cấy chuyển từ môi trường phục hồi sang môi trường chọn lọc 1 có bổ sung kháng sinh hygromycin (1,5 mg/l), nuôi trong tối ở 28°C, trong 14 ngày. Sau đó, các mô sẹo tiếp tục được chuyển sang môi trường chọn lọc 2 có nồng độ kháng sinh hygromycin (3mg/l), nuôi tối 14 ngày/ 28oC.
6 Tạo chồi: Các mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 1, không có chất kích thích sinh trưởng, nuôi
trong tối 7 ngày/ 25oC/. Các mô sẹo phôi hoá này tiếp đó được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 2 không bổ sung kháng sinh, nuôi ngoài sáng ở 25oC, liên tục chuyển môi trường tái sinh 2 cho đến khi các mô sẹo phôi hoá này tạo thành các chồi.
7 Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh: Chồi tái sinh trong môi trường tái sinh được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh ở điều kiện sáng 25oC, trong khoảng 10 - 20 ngày.
8 Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường tái sinh khi có khoảng 2 - 3 láđược chuyển ra đất trồng.