CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Hiện nay, có nhiều phương pháp được các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào thực vật như: phương pháp gián tiếp sử dụng A. tumefaciens, phương pháp trực tiếp sử dụng xung điện, vi tiêm, xử lý polyethylene glycol (PEG) và dùng súng bắn gen. Mỗi phương pháp chuyển gen đều có những ưu, nhược điểm riêng tùy vào từng đối tượng nghiên cứu khác nhau. Trong đó, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất. Ưu điểm lớn của phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A. tumefaciens là một lượng nhỏ bản sao (thường là 1 hoặc 2) kích thước tương đối lớn (có thể lớn hơn 10kb) của T-DNA với các đầu xác định được ghép vào hệ gen thực vật với sự tái sắp xếp tối thiểu, tạo ra cây chuyển gen chất lượng cao (Ishida et al., 2007). Việc chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã được biết đến như là một cơ chế đưa DNA mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao. Tuy nhiên, trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefacines không được xem là hiệu quả với cây một lá mầm (Raineri et al., 1990). Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chậm trễ trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây một lá mầm thông qua A. tumefaciens là do thiếu phản ứng gây tổn thương hoặc phản ứng gây tổn thương kém ở mô tế bào của cây một lá mầm (Repellin et al., 2001). Phản ứng này là một trong các yếu tố quan trọng trong quá trình chuyển gen. Khi tế bào bị tổn thương, chúng tiết ra các hợp chất phenol: acetosyringone(AS), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi khuẩn với tế bào thực vật. Cơ chế nhận biết này được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A. tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm chỉ có ở 1 ít loài. Vì vậy, khi tiến hành chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua A. tumefaciens, người ta thường bổ sung AS. Năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên được thu nhận nhờ lây nhiễm phôi non với A. tumefaciens (Chan et al., 1993); tiếp đó là nhiều thành công chuyển gen vào các loại ngũ cốc quan trọng khác như ngô, lúa mì, lúa mạch và cao lương. Các yếu tố quan trọng cho những thành công này gồm tối ưu hóa loại mô thực vật chuyển gen, lựa chọn vector, lựa chọn chủng A. tumefaciens và tối ưu kĩ thuật nuôi cấy mô. Ngày nay,
chuyển gen thông qua A. tumefacien khuyến khích được sử dụng trên các giống ngô do đáp ứng nuôi cấy mô tốt.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hoá chất nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
Giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) là giống ngô địa phương của Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt do Viện Nghiên cứu Ngô sàng lọc và cung cấp. Hạt ngô được gieo mầm và phát triển đến giai đoạn ba lá thì xử lý hạn nhân tạo theo phương pháp của Sheng và cộng sự (2012). Mẫu tại các thời điểm: 3 giờ và 6 giờ được thu giữ trong Nitơ lỏng và bảo quản ở -70oC.
2.1.2. Các vật liệu khác
Các vector và chủng vi khuẩn được sử dụng gồm: vector tách dòng pJET 1.2, vector tách dòng trung gian pRTL2 mang promoter RD29A, vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300, chủng vi khuẩn E. coli DH5α, E. coli DH10β, chủng vi khuẩn
A.tumefaciens EHA105. Các vật liệu này được được lưu giữ tại phòng Đa dạng sinh học hệ gen - Viện Nghiên cứu hệ gen.
2.1.3. Hoá chất
Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được thiết kế dựa trên trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen. Trình tự mồi thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi
ZmbZIP72 F 5’ AAGGGTTTCGGCTCCGTGAAC 3’
ZmbZIP72 R 5’ TAGCAAGTGCAAGTCATGTGC 3’
ZmbZIP72 SacI F 5’ ATGAGAGCTCATGGACGAGCTG 3’ ZmbZIP72 SacI R 5’ TAATGAGCTCTCACCAGGGGGC 3’
HptR 5’ GCTTTCCACTATCGGCGA 3’
TestRD29AR 5’ TGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTC 3’ ZmbZIP72SacIR 5’ TAATGAGCTCTCACCAGGGGGC 3’ Plant actinF 5’ AGCTAGCATACTCGAGGTCAT 3’ Plant actin R 5’ TATCCTCGGCGTCAGCCATC 3’
- Kit tổng hợp cDNA: First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real – Time PCR của hãng Affymetrix.
- Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: DeamTaq polymerase của hãng Thermo Scientific,…
- Kit tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific.
- Hóa chất sử dụng trong việc chọn dòng: Clone JET for cloning PCR Kit; LB; agar; các dung dịch tách chiết plasmid: Sol I (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10mM EDTA pH 8,0), Sol II (0,2M NaOH, 1% SDS), Sol III (3M CH3COOK, 11,5% Ch3COOH); Ampicillin; các enzyme giới hạn: BamHI, BglII, HindIII, SacI.
- Các hóa chất chloroform, isoamyl alcohol, Tris, acetic acid, EDTA, cồn tuyệt đối và các hóa chất chuyên dụng khác: Hãng Merck (CHLB Đức).
- Các hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Thành phần môi trường sử dụng nuôi cấy mô thực vật được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật (Frame et al. 2015)
Môi trường Thành phần
Lây nhiễm lỏng
MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7g/l + sucrose 68,4 g/l + glucose 36 g/l + AS (100uM).
Nuôi ủ - đồng nuôi cấy
MS + 2,4D 2mg/l + L-proline 0,7 g/l + sucrose 30 g/l + phytagel 2,4 g/l + AgNO3 0,85 mg/l + AS (100uM).
pH 5,8 Nuôi phục
hồi
MS + 2,4D 2mg/l + L-proline 0,7 g/l + sucrose 30 g/l + MES 0,5 g/l + phytagel 2,4g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3
0,85 mg/l pH 5,8
Chọn lọc 1 MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7 g/l + MES 0,5 g/l + sucrose 30 g/l + phytagel 2,4 g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3
0,85 mg/l + hygromycin 1,5 mg/l. pH 5,8
Chọn lọc 2 MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7 g/l + MES 0,5 g/l + sucrose 30 g/l + phytagel 2,4 g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3
0,85 mg/l + hygromycin 3 mg/l. pH 5,8
Tái Sinh 1 MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 60 g/l + phytagel 2,4 g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + hygromycin 3 mg/l.
pH 5,8
Tái Sinh 2 MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 30 g/l + casein 400mg/l + kinetin 1mg/l + nước dừa 150 ml/l + phytagel 2,4 g/l.
pH 5,8 Môi trường
ra rễ
MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 30 g/l + casein 100mg/l NAA 1mg/l + IBA 0.1 mg/l + phytagel 2,4 g/l.
pH 5,8
Các thiết bị được sử dụng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Bao gồm: Tủ lạnh 20C (Sanyo, Nhật Bản), Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt (Memmert, Đức), máy làm khô chân không (Concentrator Plus) (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh Eppendorf 5424R (Eppendorf, CHLB Đức), máy li tâm lạnh đa năng 5810R (Eppendorf, Đức), máy chạy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy PCR Master Cycler Pro S (Eppendorf, Đức), máy soi gel M-26 UVP (Mỹ), máy chụp ảnh gel (GelDoc) UVP (Mỹ), máy ủ nhiệt Thermomixer C (Eppendorf, Đức), máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Nhật), máy biến nạp xung điện Gene Pulser (Bio-Rad, Mỹ), box cấy vi sinh vật The Esco Airstream® Class II Biological Safety Cabinet (Esco, Singapore). Phòng nuôi cấy mô vô trùng, box cấy thực vật Esco laminar flow cabinets ( Esco, Singapore).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ thực vật
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Roger và đồng tác giả nhưng có cải tiến cho phù hợp với mô lá ngô, bao gồm các bước sau:
1 Nghiền lá tươi thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng. Cho toàn bộ bột lá vào ống eppendorf 1.5ml.
2 Bổ sung đệm chiết (1ml cho 100g lá) vào ống. Đảo ống vài lần hoặc vortex nhẹ để đệm chiết và bột lá trộn đều với nhau. Ủ hỗn hợp ở 65°C trong 60 phút.
4 Để hỗn hợp 15 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm mẫu ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên chuyển sang ống mới.
5 Loại protein và tạp chất bằng hỗn hợp phenol/choloroform/isoamyl alcohol (v:v:v = 25:24:1). Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên. 6 Bổ sung RNase, ủ dịch thu được ở 4˚C, 1 giờ. Dịch thu tiếp tục được tinh sạch
bằng hỗn hợp choloroform/isoamyl alcohol (v:v =24:1) . Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên.
7 Tủa DNA trong dịch thu được bằng 2 lần thể tích EtOH 100% , 0.3M CH3COONa trong ít nhất 3 giờ ở -20˚C.
8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, loại bỏ dịch, thu kết tủa.
9 Rửa kết tủa bằng cồn 70%. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, thu kết tủa.
10 Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút. Hòa lại tủa trong nước không chứa DNase. Bảo quản DNA ở -20⁰C.
2.2.2. Tách chiết RNA tổng số từ thực vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tách chiết RNA theo phương pháp sử dụng TRI Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu ngô. Quy trình thực hiện như sau:
1 Nghiền 2- 3 g mẫu thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng. 2 Bổ sung ngay 700 µl Trizol, trộn đều, sau đó chuyển sang ống eppendorf 1.5ml,
để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
3 Ly tâm 12.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC, thu dịch ở pha trên và chuyển sang ống eppendorf mới.
4 Bổ sung 300 µl Chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex trong 15 – 20 giây sau đó chuyển sang máy ly tâm, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
5 Sau khi ly tâm xong, hút dịch ở pha trên một cách cẩn thận, chuyển sang ống eppendorf 1.5 ml mới.
6 Bổ sung 300 µl 2-propanol lạnh vào mỗi ống. Ủ mẫu ở -20oC trong 1giờ để tủa RNA tổng số.
7 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch, thu tủa RNA.
8 Rửa kết tủa bằn Ethanol 70%. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC và loại bỏ dịch.
9 Làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút. 10 Hòa tan RNA tổng số trong 50µl nước đã được xử lý DEPC
11 Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước sóng 260nm. RNA tổng số được bảo quản ở -80oC.
2.2.3. Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất
Trong di truyền học, cDNA (complementary DNA) là đoạn DNA sợi đôi được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA xúc tác bởi enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất dựa trên khuôn mẫu mRNA bằng kit tổng hợp cDNA của hãng Affymetrix: First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real – Time PCR. Thành phần phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bao gồm: 2 µl primer mix 10pM, 1 µg RNA tổng số, 2 µl 10X RT Buffer, 2 µl dNTPs 10mM, 1 µl RNase Inhibitor, 1 µl M-MLV RT, và H2O. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau: 44oC - 60 phút, 92oC - 10 phút. Các cDNA sau khi được tổng hợp được kiểm tra bằng phản ứng PCR nhân gen Actin từ cặp mồi Plant Actin F/R và được lưu giữ ở tủ -20oC.
2.2.4. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR
PCR được tiến hành với thể tích là 25 µl. Bao gồm các thành phần: 2,5 µl 10X DreamTaq Buffer, 1 µl dNTPs 10mM, 1 µl mồi xuôi 10pM, 1 µl mồi ngược 10pM, 1 µl DNA khuôn (20 ng – 100ng), 0.2 µl DreamTaq DNA polymerase (5U/µl) và nước. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau:
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen Actin: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ : 95oC - 45 giây, 54oC - 45 giây, 72oC - 30 phút; 72oC - 10 phút; 4oC.
- Chu trình nhiệt với phản ứng RT-PCR phân lập gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 45 giây, 60oC - 45 giây, 72oC - 1 phút; 72oC -10 phút; 4oC.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng CDS gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1 phút; 72oC - 10 phút; 4oC.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen hygromycin: 950C-3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 54oC- 30 giây, 72oC - 50 giây; 72oC - 8 phút; 4oC.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng từ cuối promoter RD29A đến cuối gen
ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 1phút 15 giây; 72oC - 8 phút; 4oC.
2.2.5. Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose
Chúng tôi sử dụng GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific để tinh sạch sản phẩm PCR. Quy trình thực hiện:
1. Điện di sản phẩm PCR cần tinh sạch trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế: 100V 2. Sau khi điện di, nhuộm bản gel trong EtBr trong 10 phút, sau đó cắt đoạn gel có
chứa đoạn DNA cần tinh sạch chuyển sang ống eppendorf 1.5ml. 3. Bổ sung Binding Buffer vào ống eppendorf chứa gel (V:W = 1:1).
4. Ủ hỗn hợp gel + Binding Buffer ở 55oC trong 10 phút, cho tới khi miếng gel tan hoàn toàn. Trong lúc ủ, cách 2 – 3 phút dảo ống một lần để đảm bảo gel tan đều. Sau khi gel tan hoàn toàn, đem ống eppendorf đi vortex và spindown trước khi chuyển lên cột tinh sạch.
5. Chuyển dung dịch gel đã tan ở bước 4 sang cột tinh sạch. Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC. Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống.
6. Bổ sung 100 µl Binđing Buffer vào cột tinh sạch. Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC. Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống.
7. Bổ sung 700 µl Wash Buffer vào cột tinh sạch. Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC. Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống.
8. Ly tâm cột tinh sạch không chứa gì trong 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC để loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer.
10. Bỏ cột tinh sạch, DNA thu được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%và đo nồng độ. Sản phẩm sau tinh sạch được lưu giữ ở tủ lạnh – 20oC.
2.2.6. Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 2.2.6.1. Tạo dòng gen trong vector tách dòng pJET1.2 2.2.6.1. Tạo dòng gen trong vector tách dòng pJET1.2
Chúng tôi sử dụng bộ kit: CloneJET PCR Cloning Kit để xử lý đầu bằng đoạn gen và ghép nối đoạn gen với vector. Quy trình thực hiện như sau:
1. Xử lý đầu bằng đoạn gen. Thành phần phản ứng: 10 µl 2X reaction buffer, 1 µl sản phẩm PCR, 1 µl DNA blunting enzyme, 18 µl H2O.
2. Ủ hỗn hợp ở 70oC trong 5 phút sau đó đặt ngay lên đá.
3. Bổ sung thêm các thành phần sau vào trong hỗn hợp ban đầu: 1 µl pJET 1.2/blunt Cloning Vector, 1 µl T4 DNA Ligase.
4. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút. Sản phẩm sau ghép nối được sử dụng để biến nạp ngay hoặc được giữ trong tủ lạnh – 20oC.
2.2.6.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72
Vector trung gian pRTL2 RD29A mang promoter RD29A và terminator 35S được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn SacI. Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pJET 1.2_ZmbZIP72 cũng được cắt bằng enzyme giới hạn SacI để thu đoạn gen ZmbZIP72. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 16 giờ.
Các đoạn DNA này sau đó được tinh sạch bằng kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific. Đoạn ZmbZIP72 được ghép nối với vector pRTL2 đã mở vòng nhờ sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 22oC trong 1 giờ. Sản phẩm ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β.
2.2.6.3. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72
Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72
Hình 2.1.: Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72
Để thiết kế vector biểu hiện gen ZmbZIP72, chúng tôi chuyển cấu trúc biểu hiện gen
ZmbZIP72 (promoter RD29A:: ZmbZIP72:: terminator 35S) thu được khi cắt vector trung gian pRTL2 RD29A mang gen ZmbZIP72 bằng enzyme giới hạn HindIII vào vector biểu