CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72
3.2.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72
Để biểu hiện gen trong tế bào thực vật, gen ZmbZIP72 cần được đặt dưới sự điều khiển của promoter và terminator thích hợp. Chúng tôi lựa chọn promoter RD29A và terminator 35S để điều khiểu sự hoạt động của gen ZmbZIP72 trong thực vật. Chúng tôi ghép nối đoạn gen ZmbZIP72 với vector tách dòng trung gian pRTL2 có kích thước 2.6kb chứa đoạn trình tự cần thiết cho biểu hiện gen gồm promoter cảm ứng stress RD29A kích thước 841bp và terminator 35S dài 246bp, gen đích được chèn vào giữa tại điểm nhận biết của enzyme SacI. Nếu cấu trúc RD29A::ZmbZIP72::35S được gắn đúng sẽ có kích thước 1991bp. Đoạn gen ZmbZIP72 được tạo đầu dính tương ứng bằng enzyme SacI. Đồng thời, vector pRTL2 cũng được xử lý bằng enzyme SacI để mở vòng và ghép nối với nhau sau đó biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β theo phương pháp sốc nhiệt. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc Ampicillin (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi thu được nhiều khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có mang đoạn DNA đích hay không, chúng tôi chọn 36 khuẩn lạc đơn trên đĩa biến nạp nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml) ở 37oC qua đêm để tách chiết plasmid. Các plasmid từ các dòng vi khuẩn sau khi tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.10).
Hình 3.10: Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72
1 – 36: 36 dòng plasmid được tách chiết; (-): đối chứng âm là plasmid pRTL2 gốc không mang đoạn chèn
Quan sát ảnh điện di, chúng tôi chọn được một dòng plasmid số 32 có khả năng mang vector tái tổ hợp pRTL2-bZIP72. Plasmid này được xử lý với enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện, kết quả điện di trên gel agarose 08% (hình 3.11) thấy xuất hiện hai băng kích thước khoảng 2.6kb và 2k. Hai sản phẩm cắt này đúng với kích thước dự đoán khi ghép nối đoạn gen ZmbZIP72 với vector pRTL2.
Hình 3.11: Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII M: maker 1kb, 1: Sản phẩm cắt vector gốc pRTL2 không mang đoạn chèn, 2: sản
Tuy nhiên, chúng tôi chỉ sử dụng một enzyme giới hạn là SacI khi thiết kế, nên khi ghép nối đoạn gen với vector pRTL2 sẽ có hiện tượng có plasmid tái tổ hợp mang gen đúng chiều và plasmid tái tổ hợp mang gen ngược chiều. Vì vậy, plasmid tái tổ hợp số 32 trên cần được xác định chiều trước khi được sử dụng cho các thí nghiệm phía sau. Trình tự của vector pRTL2 và trình tự gen ZmbZIP72 đều có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BamHI (vị trí 834 trong vùng CDS của gen và vị trí 865 ở vùng linhker của vector), vì vậy khi sử dụng đồng thời cả 2 enzyme HindIII và BamHI sẽ xác định được chiều của gen ZmbZIP72
trong plasmid tái tổ hợp. Nếu đúng chiều, khi điện di sản phẩm cắt thì trên bản gel sẽ xuất hiện bốn băng có kích thước: 2.6kb, 1.7kb, 235bp, 76bp. Quan sát kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 0.8% (hình 3.12), chúng tôi thấy xuất hiện ba băng có kích thước: xấp xỉ 1.7 k, 2.6 kb, và 270bp, không thấy băng có kích thước dự đoán 76bp xuất hiện do kích thước của băng này nhỏ nên không quan sát thấy được trên bản gel agarose 0.8%. Ba đoạn DNA thể hiện trên đường chạy 1 hình 3.12 đúng kích thước dự đoán. Như vậy, đoạn gen ZmbZIP72 được chèn vào trong vector pRTL2 đúng chiều.
Hình 3.12: Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI và HindIII M: maker 1kb; 1: sản phẩm cắt plasmid