CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72
Trong đợt chuyển gen này, chúng tôi thu được 111 cây con chuyển gen ZmbZIP72
trong bình nuôi cấy. Tuy nhiên, khi trồng các cây non này ra giá thể và ra đất trong nhà lưới dưới tác động của môi trường, các cây non này bị chết dần và thu được 44 cây khoẻ mạnh. Các cây sống sót được gắn thẻ theo dõi và thu mẫu lá (Bảng 3.2). để tiến hành kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 bằng kỹ thuật PCR.
Bảng 3.2: Danh sách mẫu cây chuyển gen ZmbZIP72 thu được STT Số thẻ trên cây STT Số thẻ trên cây STT Số thẻ trên cây STT Số thẻ trên cây 1 117 12 128 23 174 34 200 2 118 13 129 24 175 35 201 3 119 14 130 25 176 36 202 4 120 15 131 26 177 37 203 5 121 16 167 27 178 38 204 6 122 17 168 28 190 39 205 7 123 18 169 29 191 40 211 8 124 19 170 30 192 41 212 9 125 20 171 31 193 42 213 10 126 21 172 32 194 43 214 11 127 22 173 33 195 44 215
3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen
Tách chiết DNA tổng số là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu gen sinh vật. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số rất hiệu quả từ mô thực vật đã được nghiên cứu, cải biến và ứng dụng tùy thuộc vào đối tượng và điều kiện nghiên cứu. Tách chiết DNA của thực vật thường gặp khó khăn bởi thành cellulose ảnh hưởng đến chất lượng của việc phá vỡ tế bào do khó nghiền mẫu thành bột mịn. Việc sử dụng ni tơ lỏng trong quá trình nghiền làm thành cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, giúp phá vỡ mỗi liên kết giữa các tế bào trong mô lá, đồng thời bảo vệ DNA không bị phá hủy bởi các enzyme trong tế bào. Ở đây, chúng tôi sử dụng đệm chiết chứa CTAB 2%. CTAB là hóa chất dùng trong tách chiết acid nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. Dung dịch CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan acid nuleic cao, do đó mà CTAB được dùng là chất chính trong quá trình tách DNA. Để tăng hiệu quả hoạt động của CTAB, đệm chiết được làm ấm ở 650C trước khi bổ sung vào bột lá, sau đó ủ mẫu ở 65oC. Nhiệt độ này còn có tác dụng là vỡ thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đa được DNA và biến tính một vài protein, đặc biệt là enzyme thủy phân DNA. Thay vì sử dụng protease K, trong thí nghiệm này -mecapthoetanol được sử dụng như là một một chất khử cực mạnh để loại bỏ tannin và các hợp chất polyphenol khác, giúp cho DNA thu được sạch hơn.
DNA tổng số của các cây ngô chuyển gen pCAMBIA1300 _ZmbZIP72 sống sót được pha loãng 10 lần và điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả trên hình 3.18 cho thấy, DNA được tách chiết khá nguyên vẹn, thể hiện là một băng DNA tổng số rõ nét, phù hợp cho các thí nghiệm sinh học phân tử sau đó.
Hình 3.18: DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá cây chuyển gen ZmbZIP72 thế hệ T0
3.5.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin
Trước khi kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72, chúng tôi tiến hành PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin trong các cây ngô chuyển gen pCAMBIA1300_ZmbZIP72. Sự có mặt của gen chỉ thị Hygromycin giúp cây có thể sống sót qua các giai đoạn chọn lọc trong nuôi cấy mô. Tuy nhiên, thực tế thì nhiều phôi vẫn có thể tái sinh dù không có gen kháng hygromycin. Vì vậy việc kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị bước đầu giúp chúng tôi xác định được quá trình chuyển gen có xảy ra hay không. Cặp mồi được sử dụng trong thí nghiệm PCR này khuếch đại vùng mã hóa của gen chỉ thị
hygromycin với kích thước lý thuyết là 984bp. Quan sát kết quả điện di trên hình 3.19 có thể nhận thấy ở đường chạy của đối chứng dương là sản phẩm PCR từ plasmid pCAMBIA1300_ZmbZIP72, xuất hiện một băng khá đậm, sáng, có kích thước xấp xỉ 1kb, điều này chứng tỏ phản ứng PCR xảy ra bình thường. Đối chứng âm chúng tôi sử dụng là H2O và cây không chuyển gen đều không xuất hiện băng DNA nào, cho thấy không có sự tạp nhiễm trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Ở các đường chạy 11 và 33 xuất hiện một băng sản phẩm đậm, sáng, kích thước bằng đối chứng dương. Như vậy, có thể nói rằng, gen chỉ thị hygromycin đã được chuyển vào trong hệ gen của các cây con tái sinh này. Ở các mẫu còn lại, sản phẩm PCR không xuất hiện băng DNA, như vậy, các cây này mang kết quả âm tính với gen chỉ thị hygromycin.
Hình 3.19: Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị hygromycin ở các cây chuyển gen T0
M: maker 1kb, (+): sản phẩm PCR của đối chứng dương với khuôn là plasmid pCAM1300_ZmbZIP72, (-): Sản phẩm PCR từ H2O, WT: sản phẩm PCR từ DNA
tổng số của cây ngô không chuyển gen, 1 – 44: Sản phẩm PCR của 44 mẫu DNA cây chuyển gen
3.5.3. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72
Để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện trong DNA tổng số cây chuyển gen, chúng tôi sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi nhân đặc hiệu. Bởi vì gen ZmbZIP72 là gen nội sinh ở ngô, do đó, chúng tôi sử dụng cặp mồi TestRD29A R và ZmbZIP72SacIR. Mồi TestRD29A R có vị trí bám nằm ở vùng cuối của promoter RD29A, trong khi đó mồi ZmbZIP72SacIR là mồi nằm ở vị trí cuối của gen ZmbZIP72. Việc sử dụng cặp mồi này sẽ tránh được việc nhân gen nội sinh. Theo lí thuyết, sản phẩm PCR sử dụng hai mồi trên có kích thước 1014bp.
Hình 3.20: Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0
M: maker 1kb, (+): sản phẩm PCR của đối chứng dương với khuôn là plasmid pCAM1300_ZmbZIP72, (-): Sản phẩm PCR từ H2O, WT: sản phẩm PCR từ DNA
tổng số của cây ngô không chuyển gen, 1 – 44: Sản phẩm PCR của 44 mẫu DNA cây chuyển gen
Qua ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR (hình 3.20), có thể thấy rằng mẫu đối chứng dương xuất hiện một băng khá đậm, rõ nét với kích thước xấp xỉ 1,1kb giống với kích thước lý thuyết. Đối chứng âm không lên chứng tỏ phản ứng không bị tạp nhiễm. Đối với các mẫu thí nghiệm, hầu hết các mẫu đều không xuất hiện băng DNA nào, chỉ có 2 đường chạy 11 và 33 xuất hiện một băng đậm và rõ nét có kích thước bằng với đối chứng dương. Khi chuyển gen vào tế bào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đoạn T-DNA được chuyển vào nhờ bộ máy phân tử của vi khuẩn và tế bào thực vật. Đoạn T-DNA được thiết kế bao gồm cả cấu trúc biểu hiện RD29A::ZmbZIP72::35S và gen chỉ thị thực vật
hygromycin. Do đó, theo lý thuyết, cả cấu trúc biểu hiện và gen chỉ thị cùng được chuyển vào hệ gen của cây. Các cây số 127 và 195 đều cho thấy có mặt của cả hai trình tự của gen Hyg và gen đích ZmbZIP72 khi đánh giá bằng phương pháp PCR. Tuy nhiên, PCR dương tính chưa chắc chắn 100% với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có
mặt của DNA trong mẫu phân tích: (i): trong các nghiên cứu chuyển gen nhờ A. tumefaciens, loài vi khuẩn này thường tồn tại lâu dài trong mô tế bào thực vật mặc dù đã trải qua quá trình loại bỏ vi khuẩn và chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen. Và với nhiều loại đối tượng thì vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay trong gian bào của mẫu phân tích. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (ii): gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính, (iii): gen chuyển tồn tại không hoạt động, tức là không biểu hiện thành protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên kết quả PCR có giá trị định hướng ban đầu. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành các thí nghiệm đánh giá tiếp sau đó để khẳng định sự thành công của việc chuyển cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 vào cây ngô ở các thế hệ sau.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
- Với kỹ thuật RT-PCR, đoạn gen mã hóa nhân tố phiên mã ZmbZIP72 đã được phân lập thành công từ RNA tổng số tách ở lá ngô giai đoạn ba lá được xử lý hạn 6 giờ của giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu). Gen ZmbZIP72 phân lập được có kích thước 894bp vùng CDS với hai điểm thay đổi so với trình tự tham chiếu: ở vị trí 486 A>C và vị trí 493 C>T.
- Đoạn gen ZmbZIP72 đã được thiết kế thành công vào vector biểu hiện pCAMBIA1300 dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng RD29A và tạo được chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp này làm nguyên liệu phục vụ chuyển gen thực vật.
- Đã tạo được 2 cây ngô chuyển gen T0 127 và 195 dương tính với PCR nhân gen đích
ZmbZIP72 và gen chỉ thị Hyg.
2. Kiến nghị
- Phân tích các dòng cây ngô chuyển gen qua các thế hệ T1, T2,… nhằm chọn được dòng cây ổn định về gen chuyển và có khả năng chịu hạn.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
- Phạm Thị Hằng, Hà Hồng Hạnh, Nguyễn Thùy Linh, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Huỳnh Thị Thu Huệ (2017). Thiết kế vector vào tạo chủng Agrobacteriums
mang gen ZmbZIP72 phân lập từ cây ngô. Tạp chí công nghệ sinh học 15 (2): 333- 340.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998). Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại Học Quốc Gia, Hà Nội
2. Bùi Mạnh Cường (2007). Ứng dụng công nghệ sinh học trong chon tạo giống ngô. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội (2010). Phân lập và thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn OsNAC6. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 156 (10): 7-13.
4. Nguyễn Lam Điền (2003). Một số kết quả nghiên cứu về 2 giống cỏ ngọt D3 và ST88 trồng tại Thái Nguyên. Kỉ yếu hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2 tại Huế, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội 309 – 11.
5. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013). Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22. Tạp chí Khoa học và công nghệ 11: 3-9.
6. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên (2013). Thiết kế vector biểu hiện gen chịu hạn NTCB-ZmNF-YB2 ở ngô. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 7: 31- 37
7. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy Hưng, Lê Huy Hàm (2015). Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn NF-YB2 vào một số dòng ngô Việt Nam.
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 7: 3530
8. Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội (2010). Phân lập và thiết kế vector chuyển gen mang gen điều khiển chịu hạn OsNAC1 ở lúa. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3):345- 352
9. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương và Phạm Xuân Hội (2014). Phân lập gen OsNAC10 liên quan tới tính chống chịu hạn từ giống lúa Indica. Tạp chí công nghệ sinh học 12(2): 319-326.
10. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương,Trần Lan Đài, Phan Tuấn Nghĩa và Phạm Xuân Hội (2014). Thiết kế vector biểu hiện gen OsNAC1 được điều khiển bởi promoter cảm ứng điều kiện bất lợi RD29A. Tạp chí Khoa học – Đại học Quốc gia Hà Nội 30(4): 1-10.
11. Trần Thị Cúc Hòa (2009). Tạo dòng đậu tương biến đổi gen kháng sâu và chịu hạn. Báo cáo khoa học ở Hội thảo khoa học đánh giá kết quả thực hiện đề tài, dự án công nghệ sinh học nông nghiệp - thủy sản giai đoạn 20072008, Hà Nội 7/4/2009. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 26-28
12. Trần Thị Cúc Hòa, Phạm Trung Nghĩa, Trần Ngọc Thạch, Hồ Thị Huỳnh Như, Lã Cao Thắng, Trần Thanh Hải, Nguyễn Trần Hải Bằng, Trang, V.T.K. (2015). Tạo dòng đậu tương biến đổi gene kháng sâu và chịu hạn. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 6: 19-25.
13. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Văn Trường, Bùi Mạnh Minh, Đoàn Thị Bích THảo, Nguyễn Xuân Thắng, Nông Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2014). Thiết kế vector biểu hiện mang gen modiCspB và chuyển gen này vào cây ngô. Tạp chí công nghệ sinh học 12(1): 125 – 132.
14. Đinh Thị Phòng (2001). Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học.
15. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Thị Vân, Phạm Xuân Hội (2012). Thiết kế vector chuyển gen mang gen điều khiển OsDREB1A có tiềm năng tăng cường tính chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường ở lúa. Tạp chí Công nghệ Sinh học
10(2): 271-279
16. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội (2009). Phân lập và chuyển gien điều khiển chịu hạn MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium Tạp chí sinh học 3(2).
18. Phan Đức Thịnh, Hoàng Thị Thùy, Phạm Quang Tuân, Vũ Thị Bích Hạnh, Nguyễn Thị Hân, Vũ Văn Liết (2013). Chọn lọc dòng ngô có khả năng chịu hạn dựa trên kiểu hình vào maker phân tử. Tạp chí khoa học và Phát triển 11(2): 184-193. 19. Nguyễn Đức Thuận, Luân Thị Đẹp, Nguyễn Thị Thuý Hường (2008). Kết quả đánh
giá khả năng chịu hạn của một số giống ngô lai tại tỉnh Sơn La. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 6(6): 22-25
20. Lương Văn Vàng, Vũ Văn Dũng, Vũ Hoài Sơn (2013). Nghiên cứu tạo giống ngô cho vùng khó khăn. Hội thảo quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 348 – 356.
Tài liệu tiếng Anh
21. Abdullah, A. Y., Obeidat, B. S., Muwalla, M. M., Matarneh, S. K., Ishmais, M. A. A. (2011). Growth performance, carcass and meat characteristics of black goat kids fed sesame hulls and Prosopis juliflora pods. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 24 (9): 1217- 1226
22. Belkheiri O, Mulas M (2013). The effects of salt stress on growth, water relations and ion accumulation in two halophyte Atriplex species. Environmental and Experimental Botany 86, 17–28.
23. Bhatnagar-Mathur P., Rao J. S., Vadez V., Dumbala S. R., Rathore A., Yamaguchi- Shinozaki K., (2014). Transgenic peanut overexpressing the DREB1A transcription factor has higher yields under drought stress. Mol. Breed. 33 327–340. 10.1007/s11032-013-9952-7
24. Brookes and Barfoot (2017). Farm income and production impacts of using GM crop technology 1996–2015. GM Crops & Food 8(3): 156 – 193.
25. Cai X, Chen J, Xu H, Liu S, Jiang QX, Halfmann R, Chen ZJ (2014). Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell 156(6): 1207-22.
26. Cattivelli L., Rizza F., Badeck F.W., Mazzucotelli E., Mastrangelo A.M., Francia E., Mare C., Tondelli A., Stanca A.M. (2008). Drought tolerance improvement in
crop plants: An integrative view from breeding to genomics. Field Crop. Res. 105: 1–14.
27. Century K, Reuber TL, and Ratcliffe OJ. (2008). Regulating the regulators: The future prospects for transcription-factor-based agricultural biotechnology products. Plant Physiol 147: 20–29
28. Chan, M.-T., Chang, H.-H., Ho, S.-L., Tong, W.-F. and Yu, S.-M. (1993) Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric α-amylase promoter/β-glucuronidase gene. Plant Mol. Biol.22: 491-506
29. Chapman S. C., Edmeades G. O. (1999). Selection improves tolerance to mid/late season drought in tropical maize populations. II. Direct and correlated responses among secondary traits. Crop Sci. 39: 1315–1324
30. de Paiva Rolla A. A., de Fátima Corrêa Carvalho J., Fuganti-Pagliarini R., Engels C., do Rio A., Marin S. R., (2014). Phenotyping soybean plants transformed with