Để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện trong DNA tổng số cây chuyển gen, chúng tôi sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi nhân đặc hiệu. Bởi vì gen ZmbZIP72 là gen nội sinh ở ngô, do đó, chúng tôi sử dụng cặp mồi TestRD29A R và ZmbZIP72SacIR. Mồi TestRD29A R có vị trí bám nằm ở vùng cuối của promoter RD29A, trong khi đó mồi ZmbZIP72SacIR là mồi nằm ở vị trí cuối của gen ZmbZIP72. Việc sử dụng cặp mồi này sẽ tránh được việc nhân gen nội sinh. Theo lí thuyết, sản phẩm PCR sử dụng hai mồi trên có kích thước 1014bp.
Hình 3.20: Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0
M: maker 1kb, (+): sản phẩm PCR của đối chứng dương với khuôn là plasmid pCAM1300_ZmbZIP72, (-): Sản phẩm PCR từ H2O, WT: sản phẩm PCR từ DNA
tổng số của cây ngô không chuyển gen, 1 – 44: Sản phẩm PCR của 44 mẫu DNA cây chuyển gen
Qua ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR (hình 3.20), có thể thấy rằng mẫu đối chứng dương xuất hiện một băng khá đậm, rõ nét với kích thước xấp xỉ 1,1kb giống với kích thước lý thuyết. Đối chứng âm không lên chứng tỏ phản ứng không bị tạp nhiễm. Đối với các mẫu thí nghiệm, hầu hết các mẫu đều không xuất hiện băng DNA nào, chỉ có 2 đường chạy 11 và 33 xuất hiện một băng đậm và rõ nét có kích thước bằng với đối chứng dương. Khi chuyển gen vào tế bào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đoạn T-DNA được chuyển vào nhờ bộ máy phân tử của vi khuẩn và tế bào thực vật. Đoạn T-DNA được thiết kế bao gồm cả cấu trúc biểu hiện RD29A::ZmbZIP72::35S và gen chỉ thị thực vật
hygromycin. Do đó, theo lý thuyết, cả cấu trúc biểu hiện và gen chỉ thị cùng được chuyển vào hệ gen của cây. Các cây số 127 và 195 đều cho thấy có mặt của cả hai trình tự của gen Hyg và gen đích ZmbZIP72 khi đánh giá bằng phương pháp PCR. Tuy nhiên, PCR dương tính chưa chắc chắn 100% với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có
mặt của DNA trong mẫu phân tích: (i): trong các nghiên cứu chuyển gen nhờ A. tumefaciens, loài vi khuẩn này thường tồn tại lâu dài trong mô tế bào thực vật mặc dù đã trải qua quá trình loại bỏ vi khuẩn và chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen. Và với nhiều loại đối tượng thì vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay trong gian bào của mẫu phân tích. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (ii): gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính, (iii): gen chuyển tồn tại không hoạt động, tức là không biểu hiện thành protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên kết quả PCR có giá trị định hướng ban đầu. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành các thí nghiệm đánh giá tiếp sau đó để khẳng định sự thành công của việc chuyển cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 vào cây ngô ở các thế hệ sau.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
- Với kỹ thuật RT-PCR, đoạn gen mã hóa nhân tố phiên mã ZmbZIP72 đã được phân lập thành công từ RNA tổng số tách ở lá ngô giai đoạn ba lá được xử lý hạn 6 giờ của giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu). Gen ZmbZIP72 phân lập được có kích thước 894bp vùng CDS với hai điểm thay đổi so với trình tự tham chiếu: ở vị trí 486 A>C và vị trí 493 C>T.
- Đoạn gen ZmbZIP72 đã được thiết kế thành công vào vector biểu hiện pCAMBIA1300 dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng RD29A và tạo được chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp này làm nguyên liệu phục vụ chuyển gen thực vật.
- Đã tạo được 2 cây ngô chuyển gen T0 127 và 195 dương tính với PCR nhân gen đích
ZmbZIP72 và gen chỉ thị Hyg.
2. Kiến nghị
- Phân tích các dòng cây ngô chuyển gen qua các thế hệ T1, T2,… nhằm chọn được dòng cây ổn định về gen chuyển và có khả năng chịu hạn.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
- Phạm Thị Hằng, Hà Hồng Hạnh, Nguyễn Thùy Linh, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Huỳnh Thị Thu Huệ (2017). Thiết kế vector vào tạo chủng Agrobacteriums
mang gen ZmbZIP72 phân lập từ cây ngô. Tạp chí công nghệ sinh học 15 (2): 333- 340.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998). Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại Học Quốc Gia, Hà Nội
2. Bùi Mạnh Cường (2007). Ứng dụng công nghệ sinh học trong chon tạo giống ngô. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội (2010). Phân lập và thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn OsNAC6. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 156 (10): 7-13.
4. Nguyễn Lam Điền (2003). Một số kết quả nghiên cứu về 2 giống cỏ ngọt D3 và ST88 trồng tại Thái Nguyên. Kỉ yếu hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2 tại Huế, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội 309 – 11.
5. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013). Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22. Tạp chí Khoa học và công nghệ 11: 3-9.
6. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên (2013). Thiết kế vector biểu hiện gen chịu hạn NTCB-ZmNF-YB2 ở ngô. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 7: 31- 37
7. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy Hưng, Lê Huy Hàm (2015). Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn NF-YB2 vào một số dòng ngô Việt Nam.
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 7: 3530
8. Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội (2010). Phân lập và thiết kế vector chuyển gen mang gen điều khiển chịu hạn OsNAC1 ở lúa. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3):345- 352
9. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương và Phạm Xuân Hội (2014). Phân lập gen OsNAC10 liên quan tới tính chống chịu hạn từ giống lúa Indica. Tạp chí công nghệ sinh học 12(2): 319-326.
10. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương,Trần Lan Đài, Phan Tuấn Nghĩa và Phạm Xuân Hội (2014). Thiết kế vector biểu hiện gen OsNAC1 được điều khiển bởi promoter cảm ứng điều kiện bất lợi RD29A. Tạp chí Khoa học – Đại học Quốc gia Hà Nội 30(4): 1-10.
11. Trần Thị Cúc Hòa (2009). Tạo dòng đậu tương biến đổi gen kháng sâu và chịu hạn. Báo cáo khoa học ở Hội thảo khoa học đánh giá kết quả thực hiện đề tài, dự án công nghệ sinh học nông nghiệp - thủy sản giai đoạn 20072008, Hà Nội 7/4/2009. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 26-28
12. Trần Thị Cúc Hòa, Phạm Trung Nghĩa, Trần Ngọc Thạch, Hồ Thị Huỳnh Như, Lã Cao Thắng, Trần Thanh Hải, Nguyễn Trần Hải Bằng, Trang, V.T.K. (2015). Tạo dòng đậu tương biến đổi gene kháng sâu và chịu hạn. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 6: 19-25.
13. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Văn Trường, Bùi Mạnh Minh, Đoàn Thị Bích THảo, Nguyễn Xuân Thắng, Nông Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2014). Thiết kế vector biểu hiện mang gen modiCspB và chuyển gen này vào cây ngô. Tạp chí công nghệ sinh học 12(1): 125 – 132.
14. Đinh Thị Phòng (2001). Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học.
15. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Thị Vân, Phạm Xuân Hội (2012). Thiết kế vector chuyển gen mang gen điều khiển OsDREB1A có tiềm năng tăng cường tính chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường ở lúa. Tạp chí Công nghệ Sinh học
10(2): 271-279
16. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội (2009). Phân lập và chuyển gien điều khiển chịu hạn MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium Tạp chí sinh học 3(2).
18. Phan Đức Thịnh, Hoàng Thị Thùy, Phạm Quang Tuân, Vũ Thị Bích Hạnh, Nguyễn Thị Hân, Vũ Văn Liết (2013). Chọn lọc dòng ngô có khả năng chịu hạn dựa trên kiểu hình vào maker phân tử. Tạp chí khoa học và Phát triển 11(2): 184-193. 19. Nguyễn Đức Thuận, Luân Thị Đẹp, Nguyễn Thị Thuý Hường (2008). Kết quả đánh
giá khả năng chịu hạn của một số giống ngô lai tại tỉnh Sơn La. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 6(6): 22-25
20. Lương Văn Vàng, Vũ Văn Dũng, Vũ Hoài Sơn (2013). Nghiên cứu tạo giống ngô cho vùng khó khăn. Hội thảo quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 348 – 356.
Tài liệu tiếng Anh
21. Abdullah, A. Y., Obeidat, B. S., Muwalla, M. M., Matarneh, S. K., Ishmais, M. A. A. (2011). Growth performance, carcass and meat characteristics of black goat kids fed sesame hulls and Prosopis juliflora pods. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 24 (9): 1217- 1226
22. Belkheiri O, Mulas M (2013). The effects of salt stress on growth, water relations and ion accumulation in two halophyte Atriplex species. Environmental and Experimental Botany 86, 17–28.
23. Bhatnagar-Mathur P., Rao J. S., Vadez V., Dumbala S. R., Rathore A., Yamaguchi- Shinozaki K., (2014). Transgenic peanut overexpressing the DREB1A transcription factor has higher yields under drought stress. Mol. Breed. 33 327–340. 10.1007/s11032-013-9952-7
24. Brookes and Barfoot (2017). Farm income and production impacts of using GM crop technology 1996–2015. GM Crops & Food 8(3): 156 – 193.
25. Cai X, Chen J, Xu H, Liu S, Jiang QX, Halfmann R, Chen ZJ (2014). Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell 156(6): 1207-22.
26. Cattivelli L., Rizza F., Badeck F.W., Mazzucotelli E., Mastrangelo A.M., Francia E., Mare C., Tondelli A., Stanca A.M. (2008). Drought tolerance improvement in
crop plants: An integrative view from breeding to genomics. Field Crop. Res. 105: 1–14.
27. Century K, Reuber TL, and Ratcliffe OJ. (2008). Regulating the regulators: The future prospects for transcription-factor-based agricultural biotechnology products. Plant Physiol 147: 20–29
28. Chan, M.-T., Chang, H.-H., Ho, S.-L., Tong, W.-F. and Yu, S.-M. (1993) Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric α-amylase promoter/β-glucuronidase gene. Plant Mol. Biol.22: 491-506
29. Chapman S. C., Edmeades G. O. (1999). Selection improves tolerance to mid/late season drought in tropical maize populations. II. Direct and correlated responses among secondary traits. Crop Sci. 39: 1315–1324
30. de Paiva Rolla A. A., de Fátima Corrêa Carvalho J., Fuganti-Pagliarini R., Engels C., do Rio A., Marin S. R., (2014). Phenotyping soybean plants transformed with rd29A:AtDREB1A for drought tolerance in the greenhouse and field. Transgenic Res. 23: 75–87.
31. Dong Chun-lin, Zhang Ming-yi, Zhang Yan-qin, Yang Li-li, Liang Gai-mei, Sun Jie, Lin Zhong-ping, Gou Jjian-fang (2011). Transformation of trehalose synthase gene (TPS Gene) into corn inbred line and identification of drought tolerance.
Academic Journals 10(68): 15253-15258
32. Edmeades G. O., Bolaños J., Elings A., Ribaut J.-M., Bänziger M., Westgate M. E. (2000). The role and regulation of the anthesis-silking interval in maize, in Physiology and Modeling Kernel Set in Maize. Madison, WI: CSSA Special Publication (29): 43–73
33. FAOSTAT, 2016 34. FAS/USDA, 2017.
35. Fujita Y, Fujita M, Satoh R, Maruyama K, Parvez MM, Seki M, Hiratsu K, Ohme- Takagi M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2005). AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis. Plant cell 17:3470-3488
36. Grelet J, Benamar A, Teyssier E, Avelange-Macherel MH, Grunwald D, Macherel D (2005). Identification in pea seed mitochondria of a late-embryogenesis abundant protein able to protect enzymes from drying. Plant Physiol 137: 157–167
37. Guo Z, Qian L, Liu R, Dai H, Zhou M, Zheng L, Shen B (2008). Nucleolar localization and dynamic roles of flap endonuclease 1 in ribosomal DNA replication and damage repair. Mol Cell Biol 28(13): 4310-9
38. Hu H, Dai M, Yao J, Xiao B, Li X, Zhang Q, Xiong L (2006). Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice. Proc Natl Acad Sci USA 103:1 2987–12992
39. Hu X, Li Y, Li C, Yang H, Wang W, Lu M (2010). Characterization of small heat shock proteins associated with maize tolerance to combined drought and heat stress.
J Plant Growth Regul 29 (4): 455–464
40. Huang XY, Chao DY, Gao JP, Zhu MZ, Shi M, Lin HX (2009). A previously unknown zinc finger protein, DST, regulates drought and salt tolerance in rice via stomatal aperture control. Genes Dev 23:1805–1817
41. Huawen Zou, Xiaohan Wang, Conglin Huang, Jinsong Chen, Xiuhai Zhang, Chang Luo, RongYu, Zhongyi Wu (2014). Stress - inducible expression of a gene encoding C - repeat binding factor 4 (CBF4) from Arabidopsis improved performance of transgenic maize under drought condition. POJ 7(2): 94-101.
42. Iwaki T., Guo L., Ryals J. A., Yasuda S., Shimazaki T., Kikuchi A., (2013). Metabolic profiling of transgenic potato tubers expressing Arabidopsis dehydration response element-binding protein 1A (DREB1A). J. Agric. Food Chem 61: 893– 900
43. Jakoby, M, Weisshaar, B, Droge-Laser, W (2002). bZIP transcription factors in
Arabidopsis. Trends Plant Sci 7: 106–11.
44. Kang JY, Choi HI, Im MY, Kim SY (2002). Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling. Plant Cell 14: 343-357 45. Karaba A, Dixit S, Greco R, Aharoni A, Trijatmiko KR, Marsch-Martinez N,
use efficiency in rice by expression of HARDY, an Arabidopsis drought and salt tolerance gene. Proc Natl Acad Sci. 104: 15270–15275
46. Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1999). Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat Biotechnol 17:287–291
47. Kasuga M., Miura S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004). A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress inducible Rd29A promoter improved drought- and low temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol. 45: 346–350
48. Kim S, Kang J, Cho D, Park JH, Kim SY (2004). ABF2, an ABRE binding bZIP factor, is an essential component of glucose signaling and its overexpression affects multiple stress tolerance. Plant J 40: 75–87
49. Kim SY (2006) The role of ABF family bZIP class transcription factors in stress response. Physiol Plant 126: 519–527
50. Kovtun Y, Chiu WL, Tena G, Sheen J (2000). Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc Natl Acad Sci USA 97: 2940–2945
51. Lightfoot, Mungur, Ameziane, R., Nolte, S., Long, L., Bernhard, K., Colter, A., Jones, K., Iqbal, M. J., Varsa, E., & Yong, B ( 2007 ). Improved drought tolerance of transgenic Zea mays plants that express the glutamate dehydrogenase gene (gdhA) of E. coli . Euphytica 156: 103–116.
52. Liu J, Huang X, Withers BR, Blalock E, Liu K, Dickson RC (2013). Reducing sphingolipid synthesis orchestrates global changes to extend yeast lifespan. Aging Cell 12(5):833-41
53. Lu G, Gao C, Zhong X, Han B (2009). Identification of OsbZIP72 as a positive regulator of ABA response and drought tolerance in rice. Planta 229: 605-615 54. Mundy J, Yamaguchi-Shinozaki K, Chua NH (1990). Nuclear proteins bind
conserved elements in the abscisic acid-responsive promoter of a rice rab gene. Proc Natl Acad Sci USA 87: 1406–1410
55. Nakashima K, Ishida H, Nakatomi A, Yazawa M (2012). Specific conformation and Ca(2+)-binding mode of yeast calmodulin: insight into evolutionary development.
J Biochem 152(1): 27-35
56. Nakashima K., Tran L.S., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y. (2007). Functional analysis of a NAC‐type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress‐responsive gene expression in rice. Plant J. 51, 617–630.
57. Nguyen Duy Phuong and Xuan Hoi Pham (2015). Isolation and characterization of a OsRap2.4A transcription factor and its expression in Arabidopsis for enhancing high salt and drought tolerance. Current Science 108(1): 51 – 62
58. Nguyen Duy Phuong, Tuteja Narendra, Tuan Nghia Phan and Xuan Hoi Pham (2014). Identification and characterization of a stress inducible gene OsNLI-IF
enhancing drought tolerance in transgenic tobacco. Current Science 109(3): 541 – 551
59. Nijhawan A, Jain M, Tyagi AK, Khurana JP (2008). Genomic survey and gene expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice.