CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72
2.2.6.1. Tạo dòng gen trong vector tách dòng pJET1.2
Chúng tôi sử dụng bộ kit: CloneJET PCR Cloning Kit để xử lý đầu bằng đoạn gen và ghép nối đoạn gen với vector. Quy trình thực hiện như sau:
1. Xử lý đầu bằng đoạn gen. Thành phần phản ứng: 10 µl 2X reaction buffer, 1 µl sản phẩm PCR, 1 µl DNA blunting enzyme, 18 µl H2O.
2. Ủ hỗn hợp ở 70oC trong 5 phút sau đó đặt ngay lên đá.
3. Bổ sung thêm các thành phần sau vào trong hỗn hợp ban đầu: 1 µl pJET 1.2/blunt Cloning Vector, 1 µl T4 DNA Ligase.
4. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút. Sản phẩm sau ghép nối được sử dụng để biến nạp ngay hoặc được giữ trong tủ lạnh – 20oC.
2.2.6.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72
Vector trung gian pRTL2 RD29A mang promoter RD29A và terminator 35S được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn SacI. Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pJET 1.2_ZmbZIP72 cũng được cắt bằng enzyme giới hạn SacI để thu đoạn gen ZmbZIP72. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 16 giờ.
Các đoạn DNA này sau đó được tinh sạch bằng kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific. Đoạn ZmbZIP72 được ghép nối với vector pRTL2 đã mở vòng nhờ sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 22oC trong 1 giờ. Sản phẩm ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β.
2.2.6.3. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72
Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72
Hình 2.1.: Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72
Để thiết kế vector biểu hiện gen ZmbZIP72, chúng tôi chuyển cấu trúc biểu hiện gen
ZmbZIP72 (promoter RD29A:: ZmbZIP72:: terminator 35S) thu được khi cắt vector trung gian pRTL2 RD29A mang gen ZmbZIP72 bằng enzyme giới hạn HindIII vào vector biểu hiện pCAMBIA 1300 được mở vòng bằng enzyme giới hạn HindIII. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 16 giờ.
Sản phẩm cắt sau đó được điện di trên gel agarose 0.8%, tinh sạch các đoạn DNA cần bằng kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific. Phản ứng ghép nối giữa vector đã mở vòng và cấu trúc biểu hiện gen thực hiện nhờ xúc tác của enzyme T4 ligase. Phản ứng thực hiện ở 22oC trong 1 giờ. Sản phẩm ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β.
2.2.7. Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β và A.
tumefaciens
2.2.7.1. Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β theo phương pháp sốc nhiệt
Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E. coli bằng CaCl2 lạnh dùng cho biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt
Quy trình thực hiện:
1. Chủng vi khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37oC 2. Cấy một khuẩn lạc đơn vào 3ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở 37oC, 200
vòng/phút.
3. Chuyển 0,5 ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp khoảng 3h đến khi OD600nm đạt 0,6 – 0,8 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá.
4. Ly tâm 6000 vòng/phút, 4oC, 10 phút để thu cặn tế bào.
5. Hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 20 – 30 ml CaCl2 0.1M, giữ ống tế bào trong đá 20 phút, ly tâm ở 4200 vòng/phút, 4oC, 10 phút để thu cặn tế bào.
6. Lặp lại một lần bước 5 và hòa cặn nhẹ nhàng trong 0,7 – 1,5 ml CaCl2 0.1M. 7. Chia vào mỗi ống eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung 50 µl glycerol 60%, làm
đông lạnh nhanh bằng Nitơ lỏng và giữ ở - 70oC.
Phương pháp biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
Quy trình thực hiện:
1. Ống tế bào khả biến được để trong đá 30 phút sau khi lấy ra từ tủ -70oC.
2. Hòa 7 µl sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến, sau đó tiếp tục giữ trong đá 30 phút.
3. Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút sau đó chuyển ngay xuống 4oC và giữ trong 5 phút. 4. Bổ sung 0.3 ml môi trường LB lỏng và nuôi lắc ở 37oC trong 1 giờ.
5. Sau đó vi khuẩn được cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc chọn lọc có bổ sung kháng sinh kháng sinh thích hợp 50µg/µl và nuôi qua đêm ở 37oC.
2.2.7.2. Biến nạp vector biểu hiện thực vật vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
theo phương pháp xung điện
Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens
Quy trình thực hiện:
1 Làm mới giống trên môi trường thạch YEP có bổ sung kháng sinh thích hợp. 2 Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 280C, 6 giờ.
3 Lấy 100 l dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 280C qua đêm trên 100 ml môi trường LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD660nm đạt 1-1,5.
4 Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào. Rửa cặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2- ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol.
5 Hoà tủa tế bào trong 500-700 l 10% glycerol.
6 Chia 45 l dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ ở - 700C.
Phương pháp biến nạp vào tế bào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện
Quy trình thực hiện:
1 Làm tan tế bào khả biến A. tumefaciens trong đá 5 phút.
2 Đối với mẫu thí nghiệm, thêm 3 l plasmid tái tổ hợp vào ống eppendorf chứa tế bào khả biến, trộn đều và đặt trên đá.
3 Rửa cuvette bằng cồn 100%, rửa lại bằng nước deion khử trùng rồi thấm khô. Dùng pipet chuyển hỗn hợp sang cuvette đã được làm lạnh từ trước; lau sạch bên ngoài cuvette.
4 Xung điện ở 5 ms, 12,5 kV/cm; điện trở 400Ω.
5 Bổ sung ngay 1 ml môi trường SOC vào cuvette, đảo đều và chuyển sang ống eppendorf vô trùng, lắc ở 280C trong 1 - 1,5 giờ, sau đó cấy trải trên môi trường chọn lọc.