CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô
Chúng tôi đã tiến hành xử lý hạn giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) giai đoạn ba lá trong 3và 6 giờ theo quy trình của nhóm nghiên cứu trên, và tiến hành thu thập các mẫu lá của các cây này để tách chiết RNA tổng số phục vụ thí nghiệm. Trong nghiên cứu, chúng tôi thực hiện tách chiết RNA tổng số theo phương pháp sử dụng TRI Reagent với quy trình như đã mô tả như ở phần phương pháp.
Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme RNase. Hơn nữa, RNase có mặt ở khắp nơi, có hoạt tính cao và rất bền vững với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt ở 90oC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase). Vì những lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi sự thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay DEPC (Diethylpyrocarbonate), tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần.
Các mẫu mô sau khi được nghiền mịn trong nitơ lỏng, cần được bổ sung ngay TRI Reagent để hạn chế sự hoạt động của RNase. TRI Reagent có chứa hai chất biến tính protein mạnh là phenol và guanidin isothiocyanate, khi được xử lý với hai hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein...
Sau khi phá vỡ được màng tế bào và màng nhân, việc tiếp theo là phải tiến hành loại protein và phân tách riêng các phần không chứa RNA trong hỗn hợp dung dịch chiết. Ở đây chúng tôi sử dụng chloroform để loại bỏ protein và tạp chất. Sau khi bổ sung chloroform và ly tâm, hỗn hợp dung dịch chiết phân chia thành ba pha riêng biệt: trên cùng là pha dịch chứa RNA; pha giữa chứa DNA; pha cuối là protein, cặn tế bào cùng các hợp hợp chất khác. Giữa pha trên và pha dưới được ngăn cách nhau bởi một lớp màng.
Dịch thu được ở pha trên sẽ được tủa bằng việc bổ sung 2-propanol. RNA thu được sau đó được làm sạch bằng cồn 70%. Sản phẩm RNA sau đó được kiểm tra trên gel agarose
1% (hình 3.1). Kết quả cho thấy RNA tổng số có độ sạch cao và khoảng smear đậm quanh vùng 18S – 28S cho thấy thu được lượng mRNA khá nhiều.
Hình 3.1: Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn nhân tạo M: maker 1kb, 1: RNA tổng số tách chiết từ mẫu lá ngô xử lý hạn 3 giờ, 2: RNA
tổng số tách chiết từ mẫu lá ngô xử lý hạn 6 giờ