CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72
Một trong những yếu tố quan trong quyết định sự thành công của thí nghiệm chuyển gen vào thực vật đó là lựa chọn được hệ vector biểu hiện phù hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn hệ vector pCAMBIA. Hệ thống pCAMBIA có những ưu điểm như: (1) Có số lượng bản sao lớn trong E. coli nên lượng DNA thu được lớn; (2) Vùng replicon pVS1 cho mức độ ổn định cao trong Agrobacterium; (3) Kích thước nhỏ, 7-12 kb tùy thuộc vào từng plasmid; (4) Các điểm cắt enzyme giới hạn cho phép dễ dàng lắp ráp/ chèn gen quan tâm; (5) Chọn lọc vi khuẩn bằng chloramphenicol hoặc kanamycin; (6) Chọn lọc thực vật bằng hygromycin B hoặc Kanamycin; (7) dễ dàng thiết kế các cấu trúc dung hợp biểu hiện với gen chỉ thị gusA (http://www.cambia.org).
Để tạo hệ vector biểu hiện gen ZmbZIP72 điều khiển bởi promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress RD29A, vector pRTL2_ZmbZIP72 và khung vector pCAMBIA1300 được xử lý bằng enzyme HindIII. Cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 và vector pCAMBIA1300 mạch thẳng được tinh sạch bằng kit tinh sạch, sau đó được ghép nối với nhau nhờ xúc tác của enzyme T4 ligase.
Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH10β khả biến theo phương pháp sốc nhiệt. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc Kanamycine (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi thu được nhiều khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn mang plasmid. DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc được tách chiết và điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.13).
Hình 3.13: chọn lọc plasmid pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72
1 – 20: 20 dòng plasmid được tách chiết; (-): đối chứng âm là plasmid pCAMBIA1300 gốc không mang đoạn chèn
Qua ảnh điện di, khi so sánh độ cao thấp giữa các plasmid với đối chứng âm (vector gốc không mang gen) thì thấy rằng tất cả các dòng plasmid tách chiết được đều cao hơn đối chứng, vì vậy, chúng tôi lựa chọn ra được 03 dòng plasmid 01, 02, 03 để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 trong vector pCAMBIA1300, chúng tôi cắt kiểm tra 3 dòng plasmid tái tổ hợp trên bằng enzyme BamHI. Trên vector pCAMBIA1300 có một vị trí của BamHI, đồng thời trong cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 cũng chứa hai vị trí nhận biết của BamHI. Nên khi xử lí bằng enzyme giới hạn BamHI, nếu vector biểu hiện có chứa đoạn chèn, khi điện di sẽ xuất hiện các băng có kích thước xấp xỉ 1.7kb và 1.8kb.Nếu vector không có đoạn chèn, sẽ thu được vector mở vòng (9kb). Kết quả điện di kiểm tra (hình 3.14) cho thấy rằng mẫu 01 và 03 cho kết quả là một băng đậm kích thước khoảng 1.7 – 1.8kb, mẫu 2 cho kết quả một băng khoảng 2kb.
Hình 3.14: Sản phẩm cắt plasmid pCAM1300_ZmbZIP72 bằng enzyme BamHI M: maker 1kb, 1: dòng số 01, 2: dòng số 02, 3: dòng số 03
Vì vậy, để chắc chắn hơn, chúng tôi chọn mẫu plasmid tái tổ hợp 01 để phân tích tiếp bằng enzyme giới hạn SacI và HindIII. Kết quả điện di cho thấy (hình 3.15), khi xử lý plasmid tái tổ hợp 01 với enzyme giới hạn SacI, trên ảnh điện di xuất hiện 2 băng kích thước ~9kb và ~0.9kb. Khi xử lý với HindIII, xuất hiện 2 băng kích thước ~9kb và ~2kb. Các kích thước này đều đúng với kích thước dự đoán khi thiết kế cấu trúc biểu hiện gen
ZmbZIP72. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72.
Hình 3.15: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 01 bằng enzyme SacI, HindIII M: maker 1kb, 1: Sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme SacI, 2: sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme HindIII, 3: plasmid tái tổ hợp 01 không được xử lý enzyme